易 龍，馬冠華

1.贛南師范學院生命與環(huán)境科學學院，江西省贛州市開發(fā)區(qū) 341000

2.西南大學植物生態(tài)病理研究所，重慶市北碚區(qū)天生路1號 400716

煙草體內外拮抗細菌協(xié)同控制根黑腐病及誘導寄主抗性試驗

易 龍1，2，馬冠華2

1.贛南師范學院生命與環(huán)境科學學院，江西省贛州市開發(fā)區(qū) 341000

2.西南大學植物生態(tài)病理研究所，重慶市北碚區(qū)天生路1號 400716

煙草內生細菌T295和煙草土壤根際細菌R27均能有效抑制煙草根黑腐病，為探索煙草體內外拮抗細菌協(xié)同作用于煙株的防病效果及控病機理，測定了菌株T295和R27協(xié)同作用對煙草根黑腐病的防效和對菌絲、孢子的抑制作用，以及對煙草體內苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD)、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶(SOD）等相關防御酶活性的影響。結果表明：內生細菌T295和土壤根際細菌R27協(xié)同作用于煙草能明顯提高對煙草根黑腐病的控制效果，其無菌發(fā)酵液混合處理可以明顯提高病原菌菌絲生長的抑制效果，但對孢子萌發(fā)抑制作用不明顯。經(jīng)內生細菌T295處理后的煙草，其體內5種酶活性高于R27處理，但混合菌液與T295處理的煙草酶活性變化差異不顯著，內生細菌T295和土壤根際細菌R27兩者誘導抗性未表現(xiàn)出累加效應，表明混合菌液處理的煙株誘導抗性主要與內生細菌T295能提高煙草中相關防御酶活性有關。

煙草；拮抗細菌；根黑腐病；協(xié)同控病；誘導抗性

煙草根黑腐病是由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的煙草根部真菌性病害，在煙草生長期內均可發(fā)病，尤以煙草還苗期至現(xiàn)蕾期發(fā)病較重。自20世紀70年代以來，隨著我國煙區(qū)的擴大，病害逐漸蔓延［1］，且在各產(chǎn)煙區(qū)均有發(fā)生，其中以云南、貴州、湖北等地發(fā)生嚴重，近年來此病害在山東、河南、安徽、吉林和福建等地有逐年加重趨勢。煙草是葉用經(jīng)濟作物，在生產(chǎn)中主要通過化學農(nóng)藥對煙草根黑腐病進行防治［2］，由此引起的農(nóng)藥殘留等一系列問題降低了煙葉品質并影響了卷煙安全性。生物防治是煙草生產(chǎn)上有害生物綜合治理的發(fā)展方向，作者在前期煙草根黑腐病的防治研究中，從煙草莖稈內部篩選獲得了對煙草根黑腐病菌具有較好抑制效果和控病作用、并能在煙草植株體內定殖的內生枯草芽孢桿菌T295菌株［3］。來自煙草體外的菌株R27分離自煙草根際土壤，為枯草芽孢桿菌，能抑制煙草根黑腐病菌菌絲生長［4］。但煙草體內外拮抗細菌協(xié)同作用于煙株的防治病害研究尚未見報道。因此，將內生細菌T295菌株和土壤根際細菌R27菌株協(xié)同作用于煙草，測定其對煙草根黑腐病的控制效果，并從抑菌能力、誘導抗病性等方面分析煙草體內外拮抗細菌協(xié)同作用對根黑腐病的控病機理，旨在為煙草根黑腐病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種K326種子由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供，在室內培育至10～12片真葉。供試菌株煙草根黑腐病菌由西南大學植物生態(tài)病理研究所提供。煙草根黑腐病的拮抗內生細菌T295菌株［3］和煙草根際細菌 R27［4］由前期試驗獲得。對照藥劑：70%“甲基托布津”可濕性粉劑（日本曹達株式會社）、50%“多菌靈”可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化有限公司）均為市售藥品。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌的控病作用

（1）拮抗菌的準備：將活化的拮抗菌株T295和R27參照易龍等［3］的方法進行培養(yǎng)發(fā)酵。用無菌水將發(fā)酵液配制成濃度為6×108cfu·mL-1的懸浮液，以單獨的拮抗細菌T295和R27菌液分別處理，協(xié)同控病試驗以T295和R27菌株用6×108cfu·mL-1懸浮液按1∶1（體積比）比例配制混合菌液。在5 mL發(fā)酵液中加無菌水10 mL稀釋后灌根處理煙苗，每處理15株，重復4次，設70%“甲基托布津”可濕性粉劑、50%“多菌靈”可濕性粉劑1 000倍液為藥劑對照，以未接菌的液體培養(yǎng)基處理為對照（CK），24 h后灌根接種煙草根黑腐病菌。

（2）灌根接種：將在PDA平板上培養(yǎng)9 d的煙草根黑腐病菌用無菌水洗脫孢子，調至濃度為2×105個/mL。取2 mL孢子懸浮液對煙株進行灌根接種，溫度為25～26℃，接種15 d后根據(jù)標準方法［5］調查發(fā)病嚴重度。

1.2.2 拮抗菌發(fā)酵液的抑菌作用

參照易龍等［3］的方法制備拮抗菌T295和R27無菌發(fā)酵液。設置T295無菌發(fā)酵液、R27無菌發(fā)酵液以及T295和R27兩者按1∶1混合的無菌發(fā)酵液3種處理。

（1）菌絲生長的測定：采用菌落直徑法［6］，將5 mm大小的病菌菌塊置于上述3種無菌發(fā)酵液終濃度為10%的PDA平板中央，以未接菌的液體培養(yǎng)基過濾液按比例制成的平板為對照，設3次重復。26°C培養(yǎng)3、6和9 d后，測量各處理菌落直徑，并計算抑菌率。

（2）孢子萌發(fā)的測定：將3種無菌發(fā)酵液20%的稀釋液按1∶1（體積比）與濃度為2×105個/mL病菌孢子懸浮液混合，使無菌發(fā)酵液終濃度為10%，以未接菌的液體培養(yǎng)基過濾液以相同比例處理為對照，重復3次。26°C下培養(yǎng)，每隔1 h鏡檢1次，于培養(yǎng)6、12和24 h時統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)，以芽管長度超過孢子直徑的一半為萌發(fā)標準，并計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.3 酶活性的誘導

煙草灌根噴施3種菌液（1.2.1節(jié)中配制），以未接菌的液體培養(yǎng)基處理為對照，分別于1、3、5、7、9和11 d后采集處理及對照煙葉0.5 g，冷凍保存（-80℃），用于酶活性的測定。參考李合生［7］的方法測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性；參考陳利鋒等［8］的方法測定過氧化氫酶（CAT）活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性［9］；采用鄰苯二酚法測定多酚氧化酶（PPO）活性［9］；采用NBT光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性［8］。酶活性測定試驗均重復3次。

采用SPSS軟件Duncan新復極差法進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌對煙草根黑腐病的控病作用

表1表明：拮抗菌T295和R27混合處理的煙苗發(fā)病率和發(fā)病嚴重度均低于對照和藥劑對照，經(jīng)T295和R27混合菌液處理的防治效果達85.4%。對照煙苗地上部分出現(xiàn)萎蔫癥狀，生長不良，拔出根部發(fā)現(xiàn)植株根系出現(xiàn)黑色，表現(xiàn)出煙草根黑腐病癥狀（圖1）。經(jīng)T295和R27混合菌液處理的煙苗地上部分未出現(xiàn)萎蔫癥狀，根系正常。病情指數(shù)統(tǒng)計結果表明，經(jīng)混合菌液處理的煙株與單一菌株T295、R27以及對照處理相比，差異達到顯著水平，說明混合菌液對煙草根黑腐病的防效優(yōu)于單一菌株T295和R27菌液的效果。

表1 拮抗菌對煙草根黑腐病的控病效果①

圖1 拮抗菌協(xié)同對煙草根黑腐病的防治效果

2.2 拮抗菌無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌的抑制作用

2.2.1 對根黑腐病菌菌絲生長的影響

由表2可見，試驗中3種無菌發(fā)酵液在終濃度10%條件下能有效地抑制病菌菌絲生長，在處理9 d后依然具有抑制能力，其中混合無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌的抑制效果明顯優(yōu)于單一菌液，表明T295和R27菌株無菌發(fā)酵液混合使用后存在明顯的增效效應，增強了對病菌菌絲生長的抑制能力。

表2 拮抗菌無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌菌絲生長的抑制效果

2.2.2 對根黑腐病菌孢子萌發(fā)的影響

圖2表明：拮抗菌T295、R27及其混合無菌發(fā)酵液在終濃度10%條件下對病菌孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出抑制作用。試驗中觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)6 h前對煙草根黑腐病菌孢子萌發(fā)抑制效果較好，培養(yǎng)12 h后有大量的病菌孢子萌發(fā)，但萌發(fā)的孢子生長的菌絲扭曲、前端膨大、呈畸形，不能正常生長發(fā)育。

由表3可見，拮抗菌T295和R27混合無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌孢子萌發(fā)的抑制效果與單獨使用無菌發(fā)酵液的處理無明顯差異，表明混合無菌發(fā)酵液未能增強對病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。

2.3 拮抗菌對煙草酶活性的誘導作用

經(jīng)拮抗內生細菌T295、土壤根際細菌R27及其混合菌液處理后，煙草體內PAL、POD、PPO、CAT和SOD活性變化，見圖3。從圖3可見，拮抗菌T295、R27及其混合菌液均能促使煙草體內PAL、POD、PPO、CAT和SOD酶活性發(fā)生變化。在接種病原菌后第3天酶活性變化達到最大，隨著時間的推移逐漸降低，變化趨于平穩(wěn)?；旌暇禾幚? d后POD提高216.3%，PAL提高96%，PPO提高86.3%，CAT提高153.6%，SOD提高88.4%，均顯著高于對照（P＜0.05）?？梢?，以內生細菌T295處理后煙株體內酶活性提高幅度最大，說明其誘導作用最強，來自煙草根際細菌R27誘導酶活性變化較小，相對平穩(wěn)，混合菌液處理產(chǎn)生的誘導抗性與單一使用內生細菌T295處理的效果無顯著差異，但明顯高于R27的誘導效果。

圖2 拮抗菌混合無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌孢子萌發(fā)的抑制效果

表3 拮抗菌無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

圖3 不同處理煙草體內PAL、PPO、POD、CAT和SOD酶活性的變化

3 結論與討論

煙草根黑腐病菌主要通過菌絲在寄主體內生長和擴展導致植株發(fā)病［1］。在本試驗中，拮抗菌T295和R27無菌發(fā)酵液及其混合無菌發(fā)酵液對煙草根黑腐病菌的菌絲生長均有較好的抑制作用，混合無菌發(fā)酵液的抑制效果顯著高于T295和R27單獨處理，說明T295和R27無菌發(fā)酵液混合后存在明顯的增效作用，增強了對病原菌的抑制能力，其作用機理是否與化學藥劑復配劑的增效機理相同還有待進一步試驗。雖然對孢子萌發(fā)的影響并未像抑制菌絲生長那樣表現(xiàn)出明顯的協(xié)同增效作用，但試驗中觀察到經(jīng)無菌發(fā)酵液處理后，孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管發(fā)育不良，并失去了正常菌絲的形態(tài)及繁殖能力。

經(jīng)拮抗菌T295、R27及其混合菌液處理后的煙株體內PAL、POD、PPO、CAT和SOD酶活性均有不同程度的提高。其中POD、CAT和SOD與植株體內活性氧的清除密切相關，PAL和PPO與木質素的形成和酚類物質的氧化有關，這些酶與植物系統(tǒng)抗性密切相關，在植物機體防御體系中起重要作用，此類酶活性的增強對植物的抗病性十分有利［10-12］。內生細菌T295處理的酶活性增加最為明顯，土壤根際細菌R27相比則變化較小，混合菌液誘導的酶活性與內生細菌T295單獨處理差異不明顯，說明內生細菌比土壤根際細菌更易對煙草產(chǎn)生誘導抗性，混合菌液的誘導抗性主要來自于內生細菌的誘導作用，并未表現(xiàn)出內生細菌和土壤根際細菌誘導抗性的累加效應。

本試驗中來自煙株莖內部的T295菌株和煙草根際的菌株R27均為枯草芽孢桿菌，芽孢桿菌是植物和土壤微生態(tài)區(qū)系中的優(yōu)勢菌群，能產(chǎn)生多種抗菌物質，對不同病原菌具有較強的抑制作用，已有多種性狀優(yōu)良的芽孢桿菌在植物病害生物防治中成功應用［13-16］。內生細菌能誘導寄主產(chǎn)生抗性，同時又能在寄主體內定殖和運轉；拮抗根際細菌適宜生存在寄主體表，能在體外阻止病菌的入侵，兩者混合作用于煙株后，從煙草的體外到體內都增強了抵御外界病菌入侵的能力，從而提高了生防效果。在控病試驗中也觀察到拮抗內生細菌和根際細菌協(xié)同作用對煙草根黑腐病的控病效果優(yōu)于單獨使用一種菌株的防治效果，表現(xiàn)出增效作用，因此有望成為防治煙草根黑腐病的生物農(nóng)藥。

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Synergism of and Host Resistance Induced by Antagonistic Endophytic Bacteria and Rhizobacteria Against Tobacco Black Root Rot

YI Long1,2and MA Guanhua2
1.College of Life&Environmental Sciences,Gannan Normal University,Ganzhou 341000,Jiangxi,China
2.Institute of Plant Ecology&Pathology,Southwest University,Chongqing 400716,China

Both tobacco endophytic bacterium strain T295 and rhizobacterium strain R27 can effectively inhibit tobacco black root rot（TBRR）.In order to analyze their control efficacy and mechanism,the synergism of T295 and R27 against TBRR and inhibition against hyphal growth and spore germination and effects on the activities of relative defensive enzymes,including phenylalanine ammonia lyase（PAL）,peroxidase（POD）,catalase（CAT）,polyphenol oxidase（PPO）and superoxide dismutase（SOD）were determined.The results showed that the synergy of T295 and R27 improved apparently the control efficacy against TBRR and inhibited the hyphal growth of Thielaviopsis basicola（the pathogen of TBRR）,but did not affect the inhibition of spore germination.The activities of PAL,POD,CAT,PPO and SOD in tobacco treated by T295 were higher than those treated by R27 and did not significantly differ from those treated by the mixture of T295 and R27.T295 and R27 did not present additive effect on the induced resistance,it indicated that the resistance of tobacco plants induced by the mixture mainly related to T295,which could promote the activities of relative defense enzymes in tobacco.

Tobacco;Antagonisticbacterium;Tobaccoblackrootrot;Synergisticdiseasecontrol;Inducedresistance

S43

A

1002-0861（2015）12-0009-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151202

2015-04-17

2015-06-29

中國煙草總公司科技項目“全國煙草有害生物調查”（NY2010060103007）；重慶市煙草公司科技項目“生物多樣性控制煙草土傳病害綜合防治技術研究”（2008YY01010）。

易龍（1978—），博士，教授，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：yilongswu@163.com

易龍，馬冠華.煙草體內外拮抗細菌協(xié)同控制根黑腐病及誘導寄主抗性試驗［J］.煙草科技，2015，48（12）：9-13.YI Long,MA Guanhua.Synergism of and host resistance induced by antagonistic endophytic bacteria and rhizobacteria against tobacco black root rot［J］.Tobacco Science&Technology,2015,48（12）：9-13.

責任編輯 董志堅