孫勝利，楊?lèi)?ài)紅，廖圣寶

（1.淮北職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系，安徽 淮北235000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012）

原發(fā)性高血壓（EH）是臨床上最常見(jiàn)的疾病之一，也是動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病和許多其他血管疾病的高危因素，已嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。目前，在高血壓的發(fā)病機(jī)制的探索中，除了遺傳因素，飲食因素，精神心理應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)免疫和炎癥反應(yīng)是高血壓的另一個(gè)重要機(jī)制［1］?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，高血壓病患者存在嚴(yán)重的免疫功能紊亂，細(xì)胞因子在高血壓的發(fā)生，發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮了重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用臨床降壓組方的常用中藥生地黃、熟地黃、何首烏、牡蠣、鉤藤、石決明等，以滋陰潛陽(yáng)法觀察其對(duì)高血壓動(dòng)物模型的降壓療效及淋巴細(xì)胞IL－6表達(dá)的變化，為后續(xù)深入探討滋陰潛陽(yáng)法降壓機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重150g±20 g，由安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第03號(hào)。動(dòng)物房為普通級(jí)飼養(yǎng)室，普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，動(dòng)物自由攝食、飲水，室溫控制在18－25℃。

1.2 藥物與試劑、儀器

（1）藥物：滋陰潛陽(yáng)方：生地黃15g、熟地黃15 g、何首烏20g、牡蠣30g、鉤藤20g、石決明30g，購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房；

陽(yáng)性對(duì)照藥：氯沙坦（Losartan）：50mg／片，（國(guó)藥準(zhǔn)字H20000371，批號(hào)N1049），杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。

（2）試劑：IL－6多克隆抗體（兔IgG）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，SABC染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

（3）儀器：美國(guó)產(chǎn)Model179小動(dòng)物血壓分析儀（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供）；

1.3 方法

1.3.1 模型制作方法

大鼠禁食24h后，用10%水合氯醛（0.36ml／100g體重）腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔在腹膜后近主動(dòng)脈側(cè)分離左腎動(dòng)脈，用0.2mm銀夾狹窄左腎動(dòng)脈，右腎不觸及，術(shù)后縫合腹腔并注射青霉素8萬(wàn)U／只，連續(xù)注射3－5d，常規(guī)飼養(yǎng)。待模型復(fù)制2w后，以尾動(dòng)脈收縮壓較術(shù)前升高22.6mmHg（3 kpa）以上，并超過(guò)135mmHg（18kpa）者為模型復(fù)制成功，此即為Goldblatt的二腎一夾腎性高血壓大鼠模型。假手術(shù)大鼠采用同樣手術(shù)方式，但左腎動(dòng)脈只分離不狹窄，直接縫合腹腔，其余處理同模型組大鼠。

1.3.2 血壓測(cè)定方法

大鼠37℃預(yù)熱，10－15min后用小動(dòng)物血壓分析儀測(cè)量大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓（SBP），測(cè)3次，取其均值作為該樣本的收縮壓。

1.3.3 分組方法

篩選復(fù)制成功模型大鼠30只，隨機(jī)分為模型組、滋陰潛陽(yáng)組和氯沙坦組，假手術(shù)組及正常對(duì)照組共5組，每組10只大鼠。

1.3.4 藥物制備及給藥方法

滋陰潛陽(yáng)方每劑臨床常用量為生地黃15g、熟地黃15g、何首烏20g、牡蠣30g、鉤藤20g、石決明30g，共130g。按體表面積折算大鼠30g／kg（計(jì)算方法：130g×0.018×15），以此臨床常用劑量作為大鼠滋陰潛陽(yáng)用藥劑量。將中藥按先煎后下的煎煮方法，加水煎煮三次，濾液置恒溫水浴鍋濃縮為每毫升含生藥2g，置冰箱備用。西藥氯沙坦臨床常用劑量為每人每天50mg，按以上折算方法，大鼠為0.009g／kg。將藥片研成粉末，以0.5%羧甲基纖維素鈉配置成1mg／ml混懸液。以上藥物灌胃時(shí)用量均根據(jù)大鼠體重不同進(jìn)行計(jì)算。

各治療組均在造模后2w開(kāi)始灌胃給藥，模型組、假手術(shù)組、正常對(duì)照組均給予等量相應(yīng)的生理鹽水灌胃，給藥容量（1ml／100g）。給藥時(shí)間均在每天上午10時(shí)前。持續(xù)灌胃4w。模型制備2w后和用藥4w后分別測(cè)定血壓，統(tǒng)計(jì)各組大鼠血壓變化情況，對(duì)藥物的降壓療效作出評(píng)價(jià)。

1.3.5 胸腺和脾臟中IL－6表達(dá)的檢測(cè)

用藥4w后處死大鼠，取胸腺和脾臟組織，常規(guī)固定，石蠟切片。IL－6表達(dá)的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SABC染色法，具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作，免疫組織化學(xué)結(jié)果以細(xì)胞漿呈黃色或棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。在100倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，對(duì)IL－6表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析：0＝無(wú)陽(yáng)性或非常弱陽(yáng)性，1＝陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞＜25%，2＝25%～50%，3＝50%～75%，4＝75%～100%［2］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 滋陰潛陽(yáng)法對(duì)2K1C－RHR血壓的影響

表1 各組大鼠血壓的變化

由表1可見(jiàn)：假手術(shù)組與正常對(duì)照組比較，SBP在造模后2w和用藥后4w均無(wú)明顯差異。造模后2w，模型組及用藥各組大鼠SBP明顯升高，與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。經(jīng)過(guò)4w的用藥，與模型組比較，氯沙坦組和滋陰潛陽(yáng)組大鼠SBP明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。

2.2 滋陰潛陽(yáng)法對(duì)胸腺和脾臟IL－6表達(dá)的影響

圖1 滋陰潛陽(yáng)法對(duì)胸腺和脾臟IL－6表達(dá)的影響（SABC）A：假手術(shù)組胸腺；B：假手術(shù)組脾臟；C：模型組胸腺；D：模型組脾臟；E：滋陰潛陽(yáng)組胸腺；F：滋陰潛陽(yáng)組脾臟；G：氯沙坦組胸腺；H：氯沙坦組脾臟

圖2 IL－6在各組胸腺和脾臟表達(dá)分值（SABC）經(jīng)單因素方差分析，兩兩比較：與假手術(shù)組比較，＋＋＋P＜0.001；與模型組比較，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

模型組與假手術(shù)組比較，胸腺、脾臟中淋巴細(xì)胞（少量的巨噬細(xì)胞）IL－6均表達(dá)顯著性上升（P﹤0.001）。滋陰潛陽(yáng)組和氯沙坦組與模型組比較，IL－6的表達(dá)明顯下調(diào)（P﹤0.01），而滋陰潛陽(yáng)組和氯沙坦組之間無(wú)明顯差異（圖1，圖2）。

3 討論

3.1 滋陰潛陽(yáng)方藥選取的依據(jù)

本法采用的中藥為生地黃、熟地黃、何首烏、牡蠣、鉤藤、石決明等藥，滋陰潛陽(yáng)、平肝熄風(fēng)，均為臨床降壓組方的常用中藥［3］。

3.2 2K1C－RHR動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

近代不少中醫(yī)藥工作者在已有的高血壓動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，以傳統(tǒng)中醫(yī)理論為指導(dǎo)，相繼研制出了高血壓的中醫(yī)證候模型，為開(kāi)展中醫(yī)對(duì)高血壓病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)和臨床防治研究提供了科學(xué)的手段［4－5］。根據(jù)高血壓病的中醫(yī)動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀，目前已經(jīng)成功復(fù)制出高血壓病的中醫(yī)證候模型有陰虛型、陰陽(yáng)兩虛型、實(shí)火型、肝陽(yáng)上亢型、陰虛陽(yáng)亢型［6］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，造模后篩選的大鼠血壓增高明顯，符合標(biāo)準(zhǔn)（135mmHg以上），表明2K1C－RHR造模成功。從大鼠的生物學(xué)特性來(lái)看，模型大鼠的飲水量增加、易激惹程度增加，易尖叫、驚跳、撕咬、打斗，其種種表現(xiàn)與有關(guān)的陰虛陽(yáng)亢證型報(bào)道相吻合，表明2K1C－RHR符合高血壓陰虛陽(yáng)亢證候特點(diǎn)。

3.3 滋陰潛陽(yáng)法下調(diào)2K1C－RHR胸腺和脾臟IL－6的表達(dá)

IL－6是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)和造血作用的多肽遞質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)模型組與假手術(shù)組比較，胸腺、脾臟中淋巴細(xì)胞（少量的巨噬細(xì)胞）IL－6均表達(dá)顯著性上升。滋陰潛陽(yáng)組和氯沙坦組與模型組比較，IL－6的表達(dá)明顯下調(diào)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滋陰潛陽(yáng)法能夠通過(guò)作用于淋巴細(xì)胞上AT1受體，進(jìn)而抑制PKA的表達(dá)和淋巴細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平［7－8］。近期的研究發(fā)現(xiàn)cAMP－PKA通路參與了IL－6在淋巴細(xì)胞中的表達(dá)［9－10］，因此，滋陰潛陽(yáng)法對(duì)淋巴細(xì)胞IL－6表達(dá)的下調(diào)可能是其治療高血壓病的機(jī)制之一。

4 小結(jié)

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究可見(jiàn)，滋陰潛陽(yáng)法能有效降低腎性高血壓大鼠的血壓，其下調(diào)胸腺和脾臟中淋巴細(xì)胞IL－6表達(dá)可能是其降壓機(jī)制之一。

［1］胡世云，郭進(jìn)建，郭云庚.高血壓病中醫(yī)辨證分析［J］.河北中醫(yī)，2000，22（9）：651－652.

［2］Shao－h(huán)ua SHI，Shu－sen ZHENG，Chang－ku JIA，et al.Inhibitory effect of tea polyhpenals on thansforming growth factorβ1expression in rat with cyclosporine A－induced chronic nephrotoxicity［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25（1）：98－103.

［3］程志斌，葛長(zhǎng)榮，韓劍眾.中草藥有效成分對(duì)動(dòng)物免疫功能的影響及其應(yīng)用［J］.動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2002，19（1）：1－3.

［4］廖圣寶，戴敏，劉光偉.高血壓大鼠模型中醫(yī)證候?qū)傩缘奶接懠八幬镒饔糜^察［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，9（2）：33－37.

［5］肖純，金益強(qiáng)，胡隨瑜，等.雙腎雙夾加灌附子湯法復(fù)制高血壓肝陽(yáng)上亢證大鼠模型［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2000，10（9）：20－22.

［6］李俊，何劍平，孔炳耀.高血壓病中醫(yī)動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀與應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，19（4）：321－322.

［7］廖圣寶，丁榮光，丁麗俐，等.滋水降火飲對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血壓大鼠淋巴細(xì)胞AngⅡ受體mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2002，27（7）：531－534

［8］武建勝，董炳鳳，廖圣寶.滋陰潛陽(yáng)方對(duì)高血壓大鼠淋巴細(xì)胞內(nèi)PKA蛋白表達(dá)和cAMP水平的影響［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27（1）：46－48

［9］Raskovalova T，Lokshin A，Huang X，et al.Inhibition of cytokine production and cytotoxic activity of human antimelanoma specific CD8＋and CD4＋ T lymphocytes by adenosineprotein kinase A type I signaling［J］.Cancer Res，2007，67（12）：5949－5956.

［10］王仁忠.原發(fā)性高血壓病患者血清細(xì)胞因子水平變化及貝那普利對(duì)其影響的意義分析［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（24）：28－29.