庫(kù)里松哈衣?tīng)杽e克 趙淑賢 楊 陽(yáng) 曾 涵

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 烏魯木齊 830054)

固酶氮摻雜碳納米復(fù)合物基燃料電池性能

(新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 烏魯木齊 830054)

利用摻雜氮介孔材料(NDMPC)和羧甲基殼聚糖(CMCH)機(jī)械共混的納米復(fù)合物作為固酶載體, 以滴涂-干燥法分別制備了固定漆酶(Lac)陰極和固定葡萄糖氧化酶陽(yáng)極, 組裝了有Nafion離子交換膜的葡萄糖/O2酶燃料電池. 固定漆酶電極作為燃料電池陰極和氧電化學(xué)傳感器的性能以結(jié)合旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)電極技術(shù)的循環(huán)伏安法、線(xiàn)性?huà)呙璺?LSV)法以及計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行表征, 同時(shí)使用紫外-可見(jiàn)分光光度法和石墨爐原子吸收光譜法研究酶分子在電極表面的構(gòu)型和估算電極表面載體對(duì)酶的擔(dān)載量. 測(cè)試結(jié)果表明: 固酶陰極在無(wú)電子中介體時(shí)可以實(shí)現(xiàn)漆酶活性中心T1與導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移(表觀(guān)電子遷移速率為0.013 s–1), 而且具有較小的氧還原超電勢(shì)(150 mV). 通過(guò)進(jìn)一步定量比較分子內(nèi)電子傳遞速率(1000 s–1) 、底物轉(zhuǎn)化速率(0.023 s–1)以及前述酶-導(dǎo)電基體間電子遷移速率, 可以發(fā)現(xiàn)此電極催化氧還原循環(huán)受制于酶-電極之間的電子遷移過(guò)程; 這種電極對(duì)氧的傳感性能良好: 低檢測(cè)限(0.04 μmoldm–3)、高靈敏度(12.1 μAμmol–1dm3)和良好的對(duì)氧親和力(KM= 8.2 μmoldm–3), 這種固酶陰極還具有良好的重現(xiàn)性、長(zhǎng)期使用性、熱穩(wěn)定性和pH耐受性. 組裝的生物燃料電池的開(kāi)路電壓為0.38 V, 最大能量輸出密度為19.2 μWcm–2, 最佳工作條件下使用3周后輸出功率密度仍可保持初始值的60%以上.

漆酶; 氮摻雜介孔碳材料; 羧甲基殼聚糖; 直接電子遷移; 氧還原反應(yīng); 電化學(xué)傳感器;生物燃料電池

1 引 言

漆酶(Laccase, 簡(jiǎn)稱(chēng)為L(zhǎng)ac)由于具有較高催化氧還原活力從而成為當(dāng)前研究最多的一種酶燃料電池陰極催化劑,1–3但Lac的活性中心結(jié)構(gòu)過(guò)于復(fù)雜,難以實(shí)現(xiàn)酶-電極間直接電子導(dǎo)通,4,5目前所見(jiàn)的能夠?qū)崿F(xiàn)酶-電極間有效電子導(dǎo)通的方式包括: 使用電子中介體6,7和依靠疏水–疏水作用將酶活性中心與帶大π鍵共軛體系官能團(tuán)修飾的納米器件定向連接,以實(shí)現(xiàn)酶-導(dǎo)電基體之間的直接電子遷移.8–10此外使用氧化還原聚合物水凝膠作為誘陷酶的載體也是非常有效地實(shí)現(xiàn)酶-電極間直接電子導(dǎo)通的手段.11,12但是以上這些方法都存在一些缺陷: 使用電子中介體會(huì)降低電池的輸出能量密度, 某些中介體對(duì)人體有毒副作用且易變性, 長(zhǎng)期使用性能較差;6制備氧化還原水凝膠需要使用貴重金屬, 制備工序復(fù)雜且成本高, 對(duì)生物體和環(huán)境都不友好;11,12此外文獻(xiàn)報(bào)道的多數(shù)實(shí)現(xiàn)酶-電極間直接電子遷移的固定Lac基電極在沒(méi)有底物存在的條件下觀(guān)察不到表征酶活性中心發(fā)生電子得失的電信號(hào), 因此不利于分析電極上催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué).8,9介孔納米材料主要包括近年來(lái)受到關(guān)注的介孔硅納米材料13以及摻雜氮的介孔碳納米材料14由于具有較高的導(dǎo)電能力和比表面積、可調(diào)節(jié)的多孔結(jié)構(gòu)和孔徑以及良好的對(duì)生物分子親和力等優(yōu)勢(shì), 成為制備固酶載體的適宜候選對(duì)象. 介孔材料表面存在很多親水基團(tuán)以及突出于表面的孤立芳香環(huán)等功能化基團(tuán), 當(dāng)其與酶分子接觸時(shí), 這些突出于表面的芳香環(huán)可深入酶活性中心附近而且親水基團(tuán)易于和電極表面的功能基團(tuán)化學(xué)鍵合, 不但利于穩(wěn)固地將酶分子固定在載體表面,而且憑借酶的活性中心附近疏水結(jié)合位與載體表面修飾的疏水芳香性基團(tuán)之間的作用12,15或依靠載體表面功能化基團(tuán)作為配體與酶活性中心的金屬離子之間的作用, 從而實(shí)現(xiàn)酶-電極之間的直接電子遷移.16,17另一方面, 介孔材料表面的親水基團(tuán)使之更易于在水溶液中分散, 這樣就可以避免載體固定的酶分子團(tuán)聚, 從而降低酶的催化活力.18但是介孔納米材料仍然存在一個(gè)缺陷, 即難以在基底電極表面形成均勻、穩(wěn)定的修飾層, 因此需要另一種成膜劑與之復(fù)合才可以制備性能穩(wěn)定的固酶電極. 殼聚糖及其衍生物具有黏度高, 成膜性和延展性好, 成膜穩(wěn)定性高, 機(jī)械強(qiáng)度較高且對(duì)生物分子的生物兼容性較好6等優(yōu)點(diǎn), 因此適合作為成膜劑, 但是殼聚糖及其衍生物本身并不導(dǎo)電. 如果將具有導(dǎo)電能力的摻雜氮介孔碳材料與具有良好成膜性的殼聚糖衍生物機(jī)械共混后便可得到既能實(shí)現(xiàn)酶-電極間的有效電子導(dǎo)通又具有良好力學(xué)穩(wěn)定性的固酶修飾電極. 文獻(xiàn)已有摻雜氮碳納米管固定Lac電極作為酶燃料電池陰極性能研究的相關(guān)報(bào)道,14但并沒(méi)有研究此類(lèi)電極的直接電子遷移性能, 也沒(méi)有對(duì)整個(gè)電極催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行定量分析; 此外固酶過(guò)程中額外化學(xué)試劑的加入可能影響了酶的催化性能;19前文20獲得了一種基于將殼聚糖與摻雜氮介孔碳材料機(jī)械共混所得納米復(fù)合物固定Lac電極, 雖然可以實(shí)現(xiàn)酶-電極之間的直接電子遷移, 但此電極的力學(xué)穩(wěn)定性較差, 因此無(wú)法進(jìn)一步研究其催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué), 也沒(méi)有測(cè)試基于這種電極組裝的酶燃料電池的性能. 基于文獻(xiàn)和前文所得結(jié)論, 本文以具有更高親水性和成膜性的羧甲基殼聚糖與摻雜氮介孔碳材料機(jī)械混合所得納米復(fù)合物作為載體, 制備了固酶修飾電極, 考察了這類(lèi)固酶電極的直接電化學(xué)行為, 催化底物反應(yīng)性能以及對(duì)氧的電化學(xué)傳感性能, 分析了Lac催化氧還原反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)并確定了制約催化過(guò)程的關(guān)鍵因素. 在此基礎(chǔ)上組裝了固酶葡萄糖/O2燃料電池, 評(píng)估了電池的能量輸出性能和長(zhǎng)期使用性. 本文所得結(jié)果為設(shè)計(jì)高性能固酶電極/酶燃料電池和研究酶燃料電池的構(gòu)效關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ).

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

葡萄糖氧化酶(GOx, 分子量～50000), 云芝漆酶(Lac, 分子量68000), 現(xiàn)買(mǎi)現(xiàn)用無(wú)需進(jìn)一步純化, 以及2,2'-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二胺鹽(純度: 98.5%, ABTS), 二茂鐵甲酸(純度: 98.0%, FMCA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)試劑有限公司; SBA-15介孔分子篩, 聚四氟乙烯透析膜(孔徑0.2 μm)和銦錫氧化物(ITO)玻璃片均購(gòu)自南京先鋒納米材料科技有限公司; 殼聚糖(脫乙酰度 ≥ 90%, 分子量250000, 簡(jiǎn)寫(xiě)為CTS), 羧甲基殼聚糖(脫乙酰度 ≥95%, 羧甲基接枝率 ≥ 80%, 分子量265000, 簡(jiǎn)寫(xiě)為CMCH)均購(gòu)自上海生藥生物科技有限公司; 乙二胺, CCl4, HF, 乙醇, 氫氧化鈉, 異丙醇, 氯乙酸, HAc, K3Fe(CN)6, K4Fe(CN)6, 甲醇, KCl, 丙酮, 檸檬酸三鈉, KH2PO4等試劑均為分析純; 實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖溶液為0.2 moldm–3的磷酸鹽緩沖液(縮寫(xiě)為PBS), 溶液pH值通過(guò)改變KH2PO4和檸檬酸三鈉的濃度比例來(lái)調(diào)控; 所有溶液均用Milli-Q超純水配制. 其他試劑如未特殊說(shuō)明均為分析純, 實(shí)驗(yàn)中用到的N2, O2(5N)購(gòu)自南京特氣. 2K15型高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); 掃描電鏡照片以JSM-6700F型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM, 日本電子公司JEO, 加速電壓: 0.5–30 kV)拍攝, 樣品制備系摻雜氮介孔碳材料的分散液(pH = 6.0的PBS緩沖液為分散劑)滴涂在銅網(wǎng)基底上真空干燥制得; Analyst 800型原子吸收光譜儀(美國(guó)Perkin-Elmer公司, 主機(jī): 雙光束火焰/石墨爐原子吸收分光光度計(jì), 光譜范圍: 190–870 nm); U-2810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司, 比色皿厚度1 cm); CHI-1140A型電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司), AFMSRCE型旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)電極系統(tǒng)(美國(guó)Pine公司, 電極轉(zhuǎn)速v = 50–10000 rmin–1); 作為參比電極的Ag/AgCl(飽和KCl)電極和作為工作電極的玻碳電極(GC, 直徑6 mm)均購(gòu)自天津艾達(dá)恒晟工貿(mào)有限公司, 對(duì)電極為鉑絲電極, 自制.工作電極使用前先以3500#砂紙, 1.0和0.5 μm氧化鋁粉漿拋光, 再用丙酮和三次重蒸水超聲清洗各2次,每次2 min. 文中如無(wú)特殊說(shuō)明, 所有的電極電位均為相對(duì)于NHE(標(biāo)準(zhǔn)氫參比電極)而言.

2.2 摻雜氮介孔碳納米復(fù)合物固酶電極的制備

摻雜氮介孔碳材料按照文獻(xiàn)21報(bào)道方法制備.方法簡(jiǎn)述如下: 將1.35 g乙二胺和3 g四氯化碳充分混合后, 向其中加入1.6 g煅燒過(guò)的SBA-15介孔分子篩并磁力攪拌10 min. 然后在90 °C磁力攪拌回流6h發(fā)生較為復(fù)雜的縮合反應(yīng)生成高分子模板碳氮化物, 經(jīng)聚四氟乙烯透析膜過(guò)濾獲得的深棕色混合物放在真空干燥箱中, 于0.08 MPa表壓, 65 °C條件下干燥12 h, 將干燥過(guò)的固體在研缽內(nèi)碾為細(xì)粉. 將其置于高溫反應(yīng)爐中于氮?dú)獗Ｗo(hù)(N2流速: 50 mLmin–1)氣氛中以3 °Cmin–1升溫速率加熱至600 °C,并在600 °C下加熱處理5 h直至模板碳化為止. 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)為5%的HF溶液溶解硅骨架之后回收得到介孔碳的氮化物, 以無(wú)水乙醇沖洗3次后放入干燥箱中于100 °C下干燥處理10 h后就得到摻雜氮介孔碳材料的成品, 縮寫(xiě)為NDMPC.

(1)稱(chēng)取100 mg CMCH加入10 mL pH = 6.0的PBS中, 磁力攪拌2 d可以得到CMCH的PBS溶液, 隨后移取3 mL此溶液向其中加入NDMPC 10 mg, 超聲共混30 min后得到分散均勻的黑色懸浮液; (2)向懸浮液中加入6.5 mg Lac或4.0 mg GOx粉末并磁力攪拌1 h, 隨后放入冰箱中于4 °C下儲(chǔ)存過(guò)夜; (3)將固酶復(fù)合物取出在8000 rmin–1轉(zhuǎn)速下離心15 min,倒去上清液后用少量PBS清洗固酶復(fù)合物2次, 按同樣條件離心沉降, 移除上清液后便可得到固酶復(fù)合物; (4)移取50 μL固酶復(fù)合物滴涂到GC上, 于室溫下干燥, 得到固酶復(fù)合物修飾電極, 分別標(biāo)記為L(zhǎng)ac/ CMCH-NDMPC/GC和GOx/CMCH-NDMPC. 作為對(duì)比電極的NDMPC-CTS納米復(fù)合物固定Lac電極的制備方法類(lèi)似于Lac/CMCH-NDMPC/GC, 只是成膜劑為CTS, 溶劑為10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的HAc溶液, 此電極記為L(zhǎng)ac/CTS-NDMPC/GC. 固酶復(fù)合物擔(dān)載酶的質(zhì)量和固酶催化比活力按照文獻(xiàn)17,22給出的方法進(jìn)行測(cè)定.

2.3 固酶納米復(fù)合物的表征

固酶納米復(fù)合物的形貌以?huà)呙桦婄R進(jìn)行表征.紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定固定Lac納米復(fù)合物UVVis吸收光譜的具體方法如下: 將Lac溶解于PBS中得到5.0 × 10–2gcm–3的溶液(游離Lac), 倒入比色皿中進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)定, 將Lac溶解在CTS質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)為3%的乙酸溶液(乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%)中后, 得到Lac濃度為5.0 × 10–2gcm–3的混合液, 移取此混合液200 μL均勻地涂覆在ITO玻璃片上使其在空氣中室溫干燥, 最后插入比色槽中進(jìn)行Lac-CTS復(fù)合物的UV-Vis測(cè)定; 而固定Lac的NDMPC-CTS或CMCH復(fù)合物則是按2.2節(jié)方法分別制備, 隨后分別移取兩種復(fù)合物各200 μL均勻地涂覆在ITO玻璃片上使其在空氣中室溫干燥, 最后插入比色槽中進(jìn)行測(cè)定.

2.4 納米復(fù)合物固酶電極的直接電化學(xué)

以循環(huán)伏安(CV)或線(xiàn)性?huà)呙璺?LSV)法結(jié)合旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)電極技術(shù)研究了Lac/CMCH-NDMPC/ GC的直接電化學(xué)行為及催化氧還原性能, 所有電化學(xué)測(cè)試在常規(guī)三電極電解池中進(jìn)行. 以L(fǎng)ac/CMCHNDMPC/GC作為工作電極, PBS緩沖液(pH = 4.4)作為電解質(zhì)溶液, 研究固酶電極直接電化學(xué)行為實(shí)驗(yàn)中, 實(shí)驗(yàn)前先向溶液中鼓泡通入N2除氧至少30 min,測(cè)試過(guò)程中電解液上方通入N2使溶液保持N2氣氛.在氧還原實(shí)驗(yàn)中, 實(shí)驗(yàn)前先向PBS緩沖液中不斷鼓泡通入高純O2至少15 min使溶液為氧氣飽和, 實(shí)驗(yàn)中還不斷向電解液上方通入O2使溶液上方維持O2氣氛, 所有測(cè)定均是在(25.0 ± 0.4) °C下進(jìn)行. 文中給出的電流密度以電極的活性表面積進(jìn)行歸一化處理. 活性表面積按照文獻(xiàn)23給出的方法標(biāo)定. 實(shí)驗(yàn)測(cè)定CMCH-NDMPC/GC的實(shí)際活性表面積為0.50 cm2(參見(jiàn)圖S1 (Supporting Information)).

2.5 納米復(fù)合物固酶電極作為氧電化學(xué)傳感器的性能評(píng)估

用計(jì)時(shí)電流法(CA)評(píng)估Lac/CMCH-NDMPC/ GC對(duì)氧氣的傳感性能. 計(jì)時(shí)電流曲線(xiàn)系固酶電極在含有一系列不同O2濃度的PBS溶液中(pH = 4.4)于恒定電壓下記錄響應(yīng)還原電流–時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)而得到,這一系列不同O2濃度的PBS溶液是向?yàn)镹2氣飽和的PBS溶液中加入不同體積的空氣飽和PBS溶液而制得(溶液中氧氣濃度大約是260 × 10–6moldm–3), 氧還原電位參考文獻(xiàn)6方法, 以出現(xiàn)極限擴(kuò)散電流的電位作為工作電位.

2.6 納米復(fù)合物固酶基生物燃料電池的組裝和性能測(cè)試

構(gòu)筑固定GOx的陽(yáng)極GOx/CMCH-NDMPC和固定Lac的陰極Lac/CMCH-NDMPC/GC, 放入一個(gè)玻璃制兩極室電池中, 以全氟化離子交換膜(Nafion 115, 厚度0.125 mm)作為隔膜將陽(yáng)極室和陰極室(體積各為10 mL)分隔開(kāi). 兩個(gè)極室上方各有一個(gè)進(jìn)氣口, 以導(dǎo)氣管與氣源連接, 陽(yáng)極電解液為1 mmoldm–3的除氧葡萄糖PBS緩沖溶液(pH = 6.0). 為了提高燃料電池輸出功率, 需要改善陽(yáng)極GOx與電極之間的電子遷移性能, 因此在陽(yáng)極電極液中加入FMCA為電子中介體, 其濃度恒定為0.5 mmoldm–3,陽(yáng)極室上方維持氮?dú)鈿夥? 而陰極室則充入氧氣飽和的PBS緩沖溶液(pH = 6.0), 加入的電子中介體為ABTS, 濃度恒定為1.0 mmoldm–3, 陰極室上方維持氧氣氣氛. 電阻值范圍在0–100 kΩ的外加負(fù)載與組裝的兩個(gè)電極相連接, 籍調(diào)節(jié)負(fù)載的電阻值調(diào)控電池的輸出電壓和輸出電流密度.

3 結(jié)果與討論

3.1 固酶納米復(fù)合物的表征

圖1為NDMPC和固定Lac的CMCH-NDMPC納米復(fù)合物的掃描電鏡照片. 從圖1可以看出, 固酶前的NDMPC表面比較粗糙且具有三維結(jié)構(gòu), 呈片狀分布, 每一個(gè)片狀NDMPC表面上有許多細(xì)小的微孔, 孔徑均一且都小于10 nm. 這表明NDMPC的規(guī)則碳基骨架結(jié)構(gòu)一方面提供了良好的電子通道, 同時(shí)各有序結(jié)構(gòu)之間直徑小于10 nm的孔道也給小分子底物和產(chǎn)物提供了良好的傳質(zhì)通道. 固酶納米復(fù)合物的形貌則與NDMPC有很大區(qū)別: 海綿狀的NDMPC在與CMCH充分混合并固定了Lac后, 形成了較為均勻的薄膜, 表明三者之間分散混合性良好,而且薄膜表面存在許多微孔和縫隙, 利于氧氣分子滲透進(jìn)入納米復(fù)合物內(nèi)部并和其中誘陷的Lac分子接觸發(fā)生反應(yīng), 其表面的突起塊狀物可能是納米復(fù)合物表面的Lac分子依靠分子間作用力形成的團(tuán)聚物. 圖2給出了游離Lac, Lac-CMCH, Lac/NDMPCCTS以及Lac/NDMPC-CMCH的紫外-可見(jiàn)吸收光譜. 從圖2可以看出, 游離Lac在605 nm附近出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰, 對(duì)應(yīng)于Lac氧化還原活性中心T1中心銅離子(氧化態(tài))的d-d配位躍遷, 與文獻(xiàn)24報(bào)道的結(jié)果一致. 此吸收峰可以歸屬于Lac中心Cu離子在N,O, S等雜環(huán)配位體存在時(shí)低能態(tài)d電子躍遷至高能態(tài)d軌道的d-d配位躍遷.16,20Lac-CMCH薄膜, Lac/ NDMPC-CTS以及Lac/NDMPC-CMCH在同樣的位置也有較強(qiáng)的吸收峰, 但吸收峰強(qiáng)有差異, 這種差異表明不同的載體對(duì)Lac有不同的擔(dān)載量, NDMPCCMCH復(fù)合物由于兩組分的協(xié)同效應(yīng)相對(duì)于CMCH成膜劑具有更多的酶擔(dān)載量(石墨爐原子吸收法測(cè)定Lac-CMCH, Lac/NDMPC-CTS以及Lac/ NDMPC-CMCH對(duì)Lac的擔(dān)載量分別為6.4、4.3和11.3 mgg–1), 同時(shí)還表明復(fù)合物固定的Lac較好地保持了游離Lac的 T1活性位氧化態(tài)銅中心離子的原有配位構(gòu)型及其活性中心的微環(huán)境. 此外對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明與多壁碳納米管直接接觸6 h的Lac則觀(guān)察不到此吸收峰而且不能催化ABTS的氧化, 即活性中心的配位構(gòu)型發(fā)生了變化, 從而失去了催化底物氧化的活力; 而Lac/NDMPC-CTS或CMCH納米復(fù)合物于4 °C下靜置過(guò)夜后測(cè)定的紫外-可見(jiàn)吸收光譜中仍出現(xiàn)605 nm的特征吸收峰, 且能有效地催化ABTS的氧化(兩者對(duì)ABTS的催化比活力沒(méi)有顯著差異, 分別是1.06和0.88 Umg–1). 此結(jié)果表明NDMPC相對(duì)于碳納米管而言更利于維持所固定的酶活性位中心離子的配位構(gòu)型和價(jià)態(tài). 圖3是裸玻碳電極(GCE), CMCH-NDMPC/GC以及Lac/CMCHNDMPC/GC在0.5 mmoldm–3K3Fe(CN)6和0.1 moldm–3KCl支持電解質(zhì)溶液中的CV曲線(xiàn). 從圖3可以看出: 當(dāng)電極表面覆蓋一層CMCH-NDMPC復(fù)合物后, 相對(duì)于裸玻碳電極(ΔEP= 60 mV), 陰陽(yáng)極峰電流明顯增加而峰電位差(ΔEP= 65 mV)幾乎沒(méi)有明顯變化, 中值電位正移了80 mV左右, 這表明納米復(fù)合物在沒(méi)有改變電極反應(yīng)準(zhǔn)可逆性的同時(shí)增加了電極表面的活性表面積, 促進(jìn)了K3Fe(CN)6在納米復(fù)合物修飾電極表面的氧化還原; 而Lac/CMCHNDMPC/GC的陰陽(yáng)極峰電流與前兩個(gè)電極相比更高, 峰電位差(ΔEP= 65 mV)也沒(méi)有明顯變化, 這表明固定Lac的納米復(fù)合物電極在沒(méi)有改變電極反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的前提下, 電子遷移的位阻進(jìn)一步降低, 這表明電極表面固定的酶分子有一部分可以實(shí)現(xiàn)與電極表面的導(dǎo)電基體直接電子導(dǎo)通, 這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的殼聚糖-多壁碳納米管修飾玻碳電極6和固定納米金粒子的己二硫醇修飾金盤(pán)電極25在同樣體系中的情況有所不同(不能實(shí)現(xiàn)酶-電極直接電子遷移的酶基電極在相同體系中得到循環(huán)伏安曲線(xiàn)中的陰陽(yáng)極峰電流急劇下降甚至消失).

圖1 NDMPC (a)和固定Lac 的CMCH-NDMPC納米復(fù)合物(b)的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of NDMPC (a) and CMCH-NDMPC nanocomposite with entrapped Lac molecule (b)

圖2 游離Lac的PBS (pH = 6.0), Lac-CMCH, Lac/NDMPCCTS以及Lac/NDMPC-CMCH薄膜的UV-Vis光譜Fig.2 UV-Vis spectra of PBS (pH = 6.0) containing free Lac, thin films of Lac-CMCH, Lac/NDMPC-CTS, and Lac/NDMPC-CMCH

圖3 裸玻碳電極、CMCH-NDMPC/GC以及Lac/CMCHNDMPC/GC在0.1 moldm–3KCl + 0.5 mmoldm–3K3Fe(CN)6溶液中的循環(huán)伏安(CV)曲線(xiàn)Fig.3 Cyclic voltammogram (CV) curves of bare glassy carbon electrode (GCE), CMCH-NDMPC/GC and Lac/CMCH-NDMPC/GC in 0.1 moldm–3KCl + 0.5 mmoldm–3K3Fe(CN)6solutionscan rate: 10 mVs–1

圖4 Lac/CMCH-NDMPC/GC分別在無(wú)氧和氧氣飽和的0.2 moldm–3無(wú)氧PBS (pH = 4.4)中的CV曲線(xiàn)Fig.4 CV curves of Lac/CMCH-NDMPC/GC in deaerated and oxygen-saturated 0.2 moldm–3deaerated PBS (pH = 4.4)

3.2 納米復(fù)合物固酶電極的直接電化學(xué)及催化氧還原性能

酶活性中心-導(dǎo)電基體之間是否發(fā)生直接電子遷移有兩個(gè)判據(jù):26直接證據(jù)和間接證據(jù). 直接證據(jù)就是固酶修飾電極在不含有任何底物的電解質(zhì)溶液中能觀(guān)察到表征酶活性中心發(fā)生氧化還原反應(yīng)的電化學(xué)信號(hào); 而間接證據(jù)就是底物存在條件下能觀(guān)察到底物被酶電催化氧化或還原所產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào).

圖4是固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC, 未固定Lac電極CMCH-NDMPC/GC分別在除氧的PBS溶液中以及固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和的PBS緩沖液中以相同掃描速率獲得的CV曲線(xiàn). 從圖4可以看出, Lac/CMCH-NDMPC/GC的CV曲線(xiàn)上出現(xiàn)了一對(duì)峰形不很明顯的氧化還原信號(hào), 陽(yáng)極氧化與陰極還原反應(yīng)的峰電位分別出現(xiàn)在0.74和0.54 V左右. 與之相對(duì), 未固定漆酶的納米復(fù)合物修飾電極CMCH-NDMPC/GC在所掃描的電位區(qū)間內(nèi)沒(méi)有任何可以與背景電流區(qū)分的氧化還原峰, 這表明該電極在這個(gè)電化學(xué)窗口內(nèi)是非電化學(xué)活性的, 也就不會(huì)干擾固酶電極上可能出現(xiàn)氧化還原電信號(hào)的判定和歸屬, 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果,24,26可以推測(cè)位于這個(gè)較弱的氧化還原電化學(xué)信號(hào)與電極表面固定的Lac的活性中心T1-導(dǎo)電基體NDMPC之間的直接電子遷移過(guò)程相關(guān), 但考慮到掃描速率較低的情況下峰電位差ΔEP也達(dá)到將近200 mV, 加之陰極還原信號(hào)明顯較陽(yáng)極氧化信號(hào)更強(qiáng), 因此這表明電極表面固定酶分子與導(dǎo)電基體之間電子遷移的可逆性較差. 此氧化還原信號(hào)的中值電位(大約是640 mV)與Lac活性中心T1的式電位(大約是780 mV)相差達(dá)140 mV, 這可能是由于被包埋在不導(dǎo)電的蛋白質(zhì)骨架內(nèi)部的Lac分子活性中心與導(dǎo)電基體的間距具有隨機(jī)性而非定向連接, 電荷在活性中心-導(dǎo)電基體之間的遷移需要克服較高的勢(shì)壘. 應(yīng)該指出的是, 本文制備的固酶電極與文獻(xiàn)報(bào)道的蒽基重氮鹽吸附Lac修飾玻碳電極8,9或多壁碳納米管擔(dān)載的Lac修飾電極不同, 后者在不含任何底物的緩沖液中記錄的循環(huán)伏安曲線(xiàn)上沒(méi)有明顯的表征酶活性中心自身發(fā)生電子遷移的電化學(xué)信號(hào), 從而不方便于研究電極上催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué).10要研究催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)首先需要確定導(dǎo)電的酶分子表面濃度, 根據(jù)圖4和圖3的結(jié)果可以粗略估算本文制備固酶電極上實(shí)現(xiàn)直接電子導(dǎo)通的酶分子表面濃度, 如前所述, 根據(jù)納米復(fù)合物電極固酶前后在K3Fe(CN)6溶液中掃描所得循環(huán)伏安曲線(xiàn)上氧化還原峰面積的差異Q, 以及Lac分子的橫截面積以及復(fù)合物電極的活性面積等條件間接計(jì)算得出導(dǎo)電酶分子表面濃度, 即固酶復(fù)合物修飾電極在電活性物種存在條件下氧化還原峰積分面積計(jì)算的反應(yīng)電量等于導(dǎo)電酶分子占據(jù)載體部分表面積所貢獻(xiàn)的反應(yīng)電量(由文獻(xiàn)22給定的單層緊密排列酶分子表面濃度和前述電極表面固酶量可以估算出這個(gè)占據(jù)面積)與未被酶分子覆蓋的導(dǎo)電載體面積貢獻(xiàn)的反應(yīng)電量之和. 按這種方法粗略估算電極表面實(shí)現(xiàn)電子直接導(dǎo)通的酶分子表面濃度Γ為1.1 × 10–8molcm–2, 這一數(shù)值大大高于Lac分子在電極表面按照單分子緊密排列所得的表面濃度(4.64 × 10–12molcm–2),22這一數(shù)值相當(dāng)于大約2400層緊密排列的Lac分子實(shí)現(xiàn)了與導(dǎo)電基體的直接電子導(dǎo)通, 這一數(shù)值遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的多孔納米金固酶電極的導(dǎo)電酶分子表面濃度(2.1 × 10–11molcm–2),22這表明在載體擔(dān)載酶量相近(～11 mgg–1)的條件下, 本文制備的NDMPC-CMCH納米復(fù)合物固定Lac修飾電極具有更高的導(dǎo)電酶分子表面濃度, 即該電極相對(duì)更利于酶分子與導(dǎo)電基體之間的電子遷移. 但是值得注意的是, 根據(jù)圖4所示固酶電極在無(wú)底物溶液中掃描所得循環(huán)伏安曲線(xiàn)陰極還原峰計(jì)算所得的導(dǎo)電酶分子表面濃度較按照陽(yáng)極氧化峰計(jì)算值高的多(前者是后者的2.6倍), 而按照陽(yáng)極氧化峰積分面積,由公式Γ = Q/FnVAS(式中F為法拉第常數(shù), V為掃描速率, AS為電極的活性表面積, n為電極反應(yīng)得失電子數(shù), 此值為1)計(jì)算所得的導(dǎo)電酶分子濃度接近前述數(shù)值(大約是1.0 × 10–8molcm–2), 此外圖4所示的固酶電極在電位低于0.30 V時(shí)還原電流會(huì)隨著電位負(fù)移明顯增大, 這表明會(huì)有其他物種在固酶電極上發(fā)生還原反應(yīng), 可以合理地推測(cè)可能是固酶載體中吸附的氧分子在Lac作用下電化學(xué)還原導(dǎo)致. 從圖4還可看出, 固酶電極在氧氣飽和的PBS溶液中掃描所得的CV與無(wú)氧溶液相比有較大區(qū)別: 當(dāng)電位低于0.80 V時(shí)隨著電位的負(fù)移, 陽(yáng)極氧化電流急劇下降,而陰極還原電流則有較大程度地增加, 這表明固酶電極對(duì)氧還原有明顯的電催化效應(yīng). 固酶電極上氧還原起始電位約為0.82 V, 當(dāng)電位達(dá)到0.45 V左右時(shí)電流隨電位負(fù)移變化程度較小即達(dá)到極限電流, 但當(dāng)電位低于0.30 V后還原電流又繼續(xù)相對(duì)緩慢增加. 相對(duì)于未固定Lac的納米復(fù)合物電極CMCHNDMPC/GC電極(氧還原起始電位大約是0.30 V, 參見(jiàn)圖S2 (Supporting Information)), 固酶電極氧還原的超電勢(shì)降低了520 mV. 值得注意的是未固定酶的電極催化氧還原起始電位也是在0.30 V左右, 與前述結(jié)論相一致, 可以合理推測(cè)CMCH-NDMPC納米復(fù)合物可以選擇性吸附氧氣分子, 當(dāng)電位足夠負(fù)時(shí),就可以使得吸附在納米復(fù)合物介孔中的氧分子發(fā)生電還原. 本文獲得的這種納米復(fù)合物固定Lac電極具有較低的氧還原超電勢(shì)(大約是150 mV)和較高的極限催化電流密度j (定義為在極限擴(kuò)散電流密度對(duì)應(yīng)電位處還原電流密度之差: 54.4 μAcm–2), 與早先文獻(xiàn)報(bào)道的固酶電極的性能(使用電子中介體的固酶電極催化氧還原起始電位大約是780 mV, 而固酶電極直接電催化氧還原起始電位大約是750 mV),6,10鉑系貴金屬催化劑(在相同條件下催化氧還原的起始電位660 mV)27以及其他實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的固酶電極28,29相比仍然具有一定優(yōu)勢(shì), 但與最近報(bào)道的光調(diào)控酶燃料電池Lac基陰極的性能相比則還有相當(dāng)?shù)牟罹?30按照文獻(xiàn)31給出的公式j(luò) = nFksΓ,已知極限催化電流密度j, 導(dǎo)電酶分子表面濃度Γ以及得失電子數(shù)n (由于Lac催化氧還原分子按照四電子機(jī)制進(jìn)行,16,26故n應(yīng)為4)的前提下便可以求出催化反應(yīng)的表觀(guān)速率常數(shù)ks為1.3 × 10–2s–1. 這一表觀(guān)速率常數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的幾種實(shí)現(xiàn)直接電子遷移的Lac基電極相比, 具有相近的酶-電極間電子遷移動(dòng)力學(xué)(它們的催化反應(yīng)表觀(guān)速率常數(shù)分別為0.01 s–122和0.03 s–110), 但不如貴金屬催化劑鉑在酸性溶液中催化氧還原的平均轉(zhuǎn)化率(每秒0.52 氧分子).27

圖5A為3個(gè)在不同時(shí)間按照同樣工序制備的納米復(fù)合物固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和的PBS中掃描所得CV曲線(xiàn)上極限催化電流的對(duì)比圖. 從圖5A可以看出: 三個(gè)不同Lac/CMCHNDMPC/GC電極的極限催化電流沒(méi)有明顯差異, 說(shuō)明本文制備的電極具有良好的重現(xiàn)性; 圖5B為L(zhǎng)ac/CMCH-NDMPC/GC于氧氣飽和的PBS中掃描所得極限催化電流與電極低溫儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn). 從圖5B可以看出: 新制備的Lac/CMCHNDMPC/GC在氧氣飽和的PBS中立即進(jìn)行測(cè)試所得極限催化電流和此電極在4 °C冰箱中儲(chǔ)存7 d后測(cè)試得到的極限催化電流差異很小而且氧還原起始電位沒(méi)有明顯改變(通過(guò)對(duì)比兩者的CV可以看出, 圖不再給出), 而氧還原電流密度的降低幅度低于5%: 隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)固酶電極催化氧還原性能緩慢下降, 當(dāng)?shù)蜏貎?chǔ)存時(shí)間超過(guò)10 d后電極催化氧還原性能下降迅速, 但即使電極儲(chǔ)存21 d后電極催化性能仍然可以保留初始值的大約70%, 這一結(jié)果要優(yōu)于文獻(xiàn)32報(bào)道的鋨為中心離子的氧化還原水凝膠固定Lac基電極的長(zhǎng)期使用性能(同樣溫度下儲(chǔ)存21 d后性能下降到不足初始值的15%). 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文制備納米復(fù)合物固定Lac電極不但具有很好的重現(xiàn)性, 而且其催化活性能夠保持長(zhǎng)期穩(wěn)定性. 在此基礎(chǔ)上, 我們還進(jìn)一步以CV結(jié)合旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)電極技術(shù)考察了Lac/CMCH-NDMPC/GC電極在液流剪切力作用下的力學(xué)穩(wěn)定性. 圖5C為L(zhǎng)ac/CMCHNDMPC/GC電極在氧氣飽和PBS中以不同電極旋轉(zhuǎn)速率在恒定電位掃描速率(10 mVs–1)條件下獲得的CV曲線(xiàn). 從圖5C可以看出: 與作為對(duì)比的Lac/CTSNDMPC/GC(參見(jiàn)圖S3 (Supporting Information), 此電極在剪切力作用下表面固酶薄膜會(huì)破損導(dǎo)致表面固定Lac泄漏, 從而引起催化氧還原電流明顯下降)不同, 隨著電極旋轉(zhuǎn)速率從100 rmin–1提高到2500 rmin–1, 沒(méi)有觀(guān)察到類(lèi)似于對(duì)比電極上氧還原電流隨著電極轉(zhuǎn)速提高而衰減的現(xiàn)象. 這一現(xiàn)象說(shuō)明, 本文制備的納米復(fù)合物固酶電極能承受較高的剪切力. Lac/CMCH-NDMPC/GC具有良好的力學(xué)穩(wěn)定性的原因可以歸因于: CMCH具有更高的黏度、成膜性和在水中更良好的分散性, 因此形成的納米復(fù)合物薄膜具有更高的剪切力耐受性; 此外CMCH側(cè)鏈上的羧基可以和Lac分子表面的氨基酸殘基的氨基發(fā)生相互作用而偶聯(lián), 在這些因素的協(xié)同作用下, CMCH-NDMPC納米復(fù)合物固定Lac的力學(xué)穩(wěn)定性明顯高于CTS-NDMPC復(fù)合物固定的Lac.此外無(wú)論電極旋轉(zhuǎn)速度快慢甚至于是否旋轉(zhuǎn), 所獲得的CV曲線(xiàn)沒(méi)有顯著差異, 這一現(xiàn)象與多數(shù)已知文獻(xiàn)報(bào)道的固酶電極在類(lèi)似體系中測(cè)定結(jié)果有明顯不同(后者極限催化電流隨著電極旋轉(zhuǎn)速率提高有明顯的增加),31,33這表明溶液中氧氣的傳質(zhì)速率不是該反應(yīng)的決速步驟, 納米復(fù)合物中組分NDMPC的介孔結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的表面化學(xué)環(huán)境(含氮雜環(huán)等)有助于快速吸附氧分子.21這一結(jié)論與圖4的分析結(jié)果相一致. 通過(guò)對(duì)比固酶電極Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和的不同pH值PBS緩沖液中相同掃描速率下獲得的CV曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)(圖不再給出), 隨著溶液pH的升高電極催化氧還原的起始電位沒(méi)有發(fā)生變化, 但極限催化電流明顯下降, 這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致,6,34即與游離Lac表現(xiàn)的催化活力–pH依賴(lài)關(guān)系相似, 隨溶液pH升高, 酶活性中心T3優(yōu)先結(jié)合溶液中的OH–而非氧分子, 因此降低了氧還原催化電流. 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果(參見(jiàn)圖S4 (Supporting Information))也表明納米復(fù)合物固定Lac催化氧還原性能與游離Lac類(lèi)似, 存在一個(gè)最佳pH, 但與游離Lac不同,34最佳pH值出現(xiàn)在4.4, 因此pH = 4.4被設(shè)定為測(cè)試固酶電極催化氧還原性能的工作pH. 此外從Lac/CMCHNDMPC/GC的極限催化電流–溫度關(guān)系圖(參見(jiàn)圖S4)還可以看出: 在測(cè)試的溫度區(qū)間內(nèi), 隨著溶液溫度的增高, 電極極限催化電流在65 °C之前隨之緩慢升高, 在此之后隨著溫度繼續(xù)升高, 催化電流迅速下降, 這一結(jié)果與游離Lac34以及文獻(xiàn)33報(bào)道的氧化還原水凝膠固酶電極催化活力/催化電流–溫度關(guān)系結(jié)論相一致, 根據(jù)文獻(xiàn)提供的方法可以粗略估算電極表面固定Lac催化氧還原反應(yīng)的表觀(guān)活化能是12.8 kJmol–1, 酶變性的活化能是78.1 kJmol–1.33從上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和計(jì)算的活化能可以推斷Lac在納米復(fù)合物載體上的固定方式接近于化學(xué)吸附或化學(xué)鍵合,這也解釋了固酶電極力學(xué)性能優(yōu)越和重現(xiàn)性, 長(zhǎng)期使用性能良好的原因.

圖5 在0.2 moldm–3氧氣飽和的PBS(pH = 4.4)中Lac/CMCH-NDMPC/GC催化氧還原性能的重現(xiàn)性(A), 長(zhǎng)期穩(wěn)定性(B)以及力學(xué)穩(wěn)定性(C)Fig.5 Reproducibility (A), long-term stability (B), and mechnical stability (C) in catalytic effect on oxygen reduction reaction (ORR) of Lac/CMCH-NDMPC/GC in 0.2 moldm–3oxygen-bubbled PBS (pH = 4.4)

圖6為不同酶固載量的Lac/CMCH-NDMPC/ GC在氧氣飽和PBS緩沖液中以相同掃描速率獲得的LSV曲線(xiàn), 從圖6可以看出: 隨著電極表面固定Lac量從0.42 mg上升到1.50 mg時(shí), 催化氧還原起始電位沒(méi)有明顯的變化, 但催化氧還原電流隨之線(xiàn)性增大(參見(jiàn)圖6插圖). 但當(dāng)載體對(duì)Lac的擔(dān)載量即電極表面固酶量達(dá)到一定數(shù)值(約1.50 mg)之后, 即便繼續(xù)增加電極表面固酶質(zhì)量, 相應(yīng)的電極的極限催化氧還原電流也不再增加(即使電極表面酶擔(dān)載量遠(yuǎn)超過(guò)1.50 mg時(shí)亦是如此, 參見(jiàn)圖6插圖), 這一結(jié)果與文獻(xiàn)35建立模型預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致, 這就是所謂的“電極表面吸附的導(dǎo)電酶分子極限濃度”. 而根據(jù)前述計(jì)算得到的電極表面實(shí)現(xiàn)電子導(dǎo)通的酶分子表面濃度(1.1 × 10–8molcm–2)和Lac的分子量(68000)可以粗略估算出實(shí)現(xiàn)直接電子導(dǎo)通的酶占固載總量的1/4, 這一數(shù)值高于1-芘基丁酸琥珀酰亞胺酯功能化多壁碳納米管/碳紙固酶電極表面實(shí)現(xiàn)直接電子導(dǎo)通酶占固載酶總量的百分?jǐn)?shù)(大約15%),10更遠(yuǎn)超過(guò)文獻(xiàn)22報(bào)道的納米多孔金固酶電極上實(shí)現(xiàn)直接電子導(dǎo)通的酶占固酶總數(shù)的百分比(只有大約1/400). 從Lac/CMCH-NDMPC/GC靜態(tài)時(shí)在氧氣飽和的PBS中以10 mVs–1掃描獲得的Tafel曲線(xiàn)(參見(jiàn)圖S5 (Supporting Information))中可以看出:同文獻(xiàn)9報(bào)道的固酶稠環(huán)芳烴修飾熱解石墨電解電極在飽和氧氣的檸檬酸鈉緩沖液(pH = 4.0)中的Tafel曲線(xiàn)類(lèi)似, 本文制備的固酶電極在氧氣飽和的PBS中的Tafel曲線(xiàn)也沒(méi)有線(xiàn)性區(qū)域, 而且塔菲爾斜率為118 mV(對(duì)應(yīng)于單電子反應(yīng))時(shí)對(duì)應(yīng)的電位(～755 mV)非常接近于CV曲線(xiàn)中還原電流開(kāi)始急劇增高的電位(770 mV), 同時(shí)此電位也很接近漆酶活性位T1位的式電位, 這與文獻(xiàn)9報(bào)道的結(jié)論相一致, 即表明固定Lac電極催化氧還原首先是在T1位得到電子,隨后再通過(guò)分子內(nèi)電子傳遞鏈到達(dá)由三個(gè)銅離子構(gòu)成的T2/T3三核銅簇, 并在T2式電位(大約是400 mV)附近達(dá)到極限電流或峰電流(T2銅形成的橋聯(lián)過(guò)氧化物分解對(duì)應(yīng)電位). 這種納米復(fù)合物固定Lac之所以能夠?qū)崿F(xiàn)與電極之間的直接電子導(dǎo)通,與NDMPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)聯(lián), 這種介孔碳材料含有sp2的碳原子和吡啶結(jié)構(gòu)的氮原子, 因此可以憑借共軛體系之間存在的疏水–疏水作用使介孔碳材料接近Lac分子T1活性位附近的疏水結(jié)合位, 同時(shí)雜原子與Lac分子中的Cu離子之間的相互作用(例如雜原子充當(dāng)軸向配體)16可能有利于酶分子以合適的構(gòu)象定位在介孔碳材料表面, 利于電子在酶-導(dǎo)電基體NDMPC之間的直接遷移.

3.3 組裝葡萄糖/氧氣生物燃料電池的性能

與前述Lac/CMCH-NDMPC/GC不同, 固酶陽(yáng)極GOx/CMCH-NDMPC在沒(méi)有電子中介體和底物葡萄糖存在時(shí), 觀(guān)察不到任何表征GOx活性中心發(fā)生電子得失或酶催化底物氧化的電信號(hào)(即產(chǎn)生的CV沒(méi)有明顯區(qū)別, 圖不再給出), 也不能有效催化葡萄糖的氧化(即電極在含葡萄糖與不含葡萄糖的無(wú)氧溶液中掃描所得LSV沒(méi)有明顯區(qū)別, 圖不再給出), 因此必須加入常用的電子中介體FMCA來(lái)促進(jìn)酶活性中心和導(dǎo)電基體之間的有效電子遷移, 以達(dá)到有效催化底物葡萄糖的目的. 圖7為固酶陽(yáng)極在含不同濃度葡萄糖的0.2 moldm–3無(wú)氧PBS(0.5mmoldm–3FMCA)中的LSVs. 從圖7可以看到, 在不含底物葡萄糖時(shí), 只有FMCA的氧化峰出現(xiàn)(氧化峰電位在560 mV附近, 與文獻(xiàn)36報(bào)道值(540 mV)相近),當(dāng)加入不同濃度的葡萄糖時(shí), 固酶電極催化葡萄糖氧化的起始電位均始于370 mV附近, 且隨著加入葡萄糖濃度的增加, 氧化峰電流隨之線(xiàn)性增大(參見(jiàn)圖S6 (Supporting Information)), 但當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)40 mmoldm–3之后, 極限催化電流增長(zhǎng)速度下降, 繼續(xù)緩慢增長(zhǎng)直至達(dá)到穩(wěn)態(tài)催化電流為止. 值得注意的是, 當(dāng)陰陽(yáng)極底物濃度相近, 掃描速率相同, 且pH值均為6時(shí)(陰極氧氣和陽(yáng)極葡萄糖濃度的濃度都是1.1 mmoldm–3), 陰極極限催化電流(參見(jiàn)圖S4)是陽(yáng)極極限催化電流的大約6倍之多, 這與文獻(xiàn)37,38報(bào)道的情況有明顯不同, 這表明陰極氧氣擴(kuò)散傳質(zhì)過(guò)程不是影響整個(gè)電池性能的關(guān)鍵, 氧氣分子在載體的快速吸附很可能阻止了陽(yáng)極上的GOx與葡萄糖之間的化學(xué)反應(yīng)(另外氧氣分子和GOx分子之間的快速化學(xué)反應(yīng)速率(600 s–1)39也比葡萄糖氧化反應(yīng)的速率和FMCA在電極表面電化學(xué)氧化還原速率快得多).

圖6 不同酶固載量的Lac/CMCH-NDMPC/GC在氧氣飽和0.2 moldm–3PBS(pH = 4.4)中的LSVsFig.6 LSVs of Lac/CMCH-NDMPC/GC in 0.2 moldm–3oxygen-saturated PBS (pH = 4.4) with different enzymeloading amounts

圖7 GOx/CMCH-NDMPC/GC在含不同濃度葡萄糖的0.2 moldm–3無(wú)氧PBS (pH = 6.0, 0.5 mmoldm–3FMCA)中的LSVsFig.7 LSVs of GOx/CMCH-NDMPC/GC in 0.2 moldm–3deaerated PBS (pH = 6.0) with 0.5 mmoldm–3FMCA at different concentration level of glucose

圖8為CMCH-NDMPC納米復(fù)合物固酶葡萄糖/ O2燃料電池于特定測(cè)試體系(如前所述, 實(shí)現(xiàn)直接電子導(dǎo)通的Lac與導(dǎo)電基體之間電子遷移的速率0.01 s–1比較低, 為了改善陰極電子遷移性能引入了最常用且性能相對(duì)最好的ABTS6)中得到的極化和性能曲線(xiàn). 從圖8中可以看出: 固酶燃料電池的開(kāi)路電壓(OCV)大約是0.38 V , 在0.16 V處呈現(xiàn)的最大輸出能量密度大約是19.2 μWcm–2. 由于酶-電極間遷移速率不夠快以及存在隔膜電阻等因素的綜合影響,本文制備的酶基燃料電池的OCV不但和理論上此電池最大輸出電壓0.87 V相比較存在490 mV的電壓差, 就是與文獻(xiàn)報(bào)道的羥基磷灰石-多壁碳管固酶基燃料電池的OCV (0.58 V),23多壁碳納米管固定Lac基燃料電池的OCV (0.62 V)28以及碳納米管基葡萄糖/AA-O2酶燃料電池的性能(OCV 0.62–0.84 V)40相比也有不小的差距, 大體與文獻(xiàn)報(bào)道的固定Lac納米石墨烯薄片修飾電極基燃料電池的OCV (0.44 V)38相當(dāng). 這可以歸因于載體固定的酶分子并沒(méi)有完全實(shí)現(xiàn)活性中心與導(dǎo)電介質(zhì)的定向連接, 活性中心與導(dǎo)電介質(zhì)的間距排布仍然具有隨機(jī)性. 但是本文制備的燃料電池的輸出能量密度相比于上述文獻(xiàn)報(bào)道的燃料電池仍然具有一定的優(yōu)勢(shì): 這些電池在相應(yīng)電壓處最大輸出能量密度分別是: 15.8 μWcm–2(0.28 V),2310.0 μWcm–2,28大致和文獻(xiàn)報(bào)道的酶, 中介體和多壁納米管復(fù)合物基葡萄糖/O2燃料電池41的最大輸出能量密度(～20 μWcm–2)相當(dāng), 但是只有固定Lac納米石墨烯薄片修飾電極基燃料電池38最大輸出能量密度(57.8 μWcm–2)的1/3左右.41從固酶葡萄糖/O2燃料電池最大輸出能量密度與工作時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)(參見(jiàn)圖S7 (Supporting Information),可以看出7 d之內(nèi)隨著電池使用時(shí)間的延長(zhǎng), 電池最大輸出功率隨之緩慢降低, 電池使用7 d之后最大功率密度仍然可以保持最初值的90%以上; 當(dāng)電池工作時(shí)間超過(guò)7 d之后, 工作效率下降速度明顯加快,但即便電池使用時(shí)間3 week之后電池的輸出功率密度仍可達(dá)到初始值的60%以上, 這一結(jié)果優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的氧化還原水凝膠固定Lac基電池的長(zhǎng)期使用性能(使用3 week后功率密度不到初始值的20%和40%).32,33綜上所述, 本文制備的CMCH-NDMPC不但對(duì)所固載的酶(無(wú)論是GOx還是Lac)具有良好的生物親和力, 使其具有較高的催化活力而且具有良好的長(zhǎng)期使用性能, 但此固酶燃料電池的能量輸出性能還有進(jìn)一步改善的余地.

3.4 Lac/CMCH-NDMPC/GC作為氧電化學(xué)傳感器的性能

圖9為L(zhǎng)ac/CMCH-NDMPC/GC和另一種作為對(duì)比電極的Lac/NGPs-modified/GC(電極制備參見(jiàn)參考文獻(xiàn)38)分別在不含電子中介體ABTS的無(wú)氧PBS溶液中, 緩慢加入不同體積空氣飽和PBS溶液時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)電流與時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn), 插圖則是Lac/ CMCH-NDMPC/GC對(duì)氧氣的響應(yīng)極限催化電流與底物氧分子濃度之間的關(guān)系曲線(xiàn). 從圖9及插圖可以看出: Lac/CMCH-NDMPC/GC在無(wú)中介體存在時(shí)對(duì)氧分子有強(qiáng)烈而迅速的響應(yīng), 即高靈敏度(為12.1μAμmol–1dm3), 這一數(shù)值遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道6的殼聚糖-多壁碳納米管固定Lac電極在擴(kuò)散型電子中介體ABTS存在時(shí)對(duì)氧分子的靈敏度(27.3 μAmmol–1dm3). 此種固酶電極對(duì)氧的檢測(cè)限可以低至0.04 μmoldm–3, 這一數(shù)值與文獻(xiàn)6報(bào)道的固酶電極(7.8 μmoldm–3)相比低得多, 結(jié)合根據(jù)雙倒數(shù)L-B曲線(xiàn)擬合所得的固酶電極對(duì)氧分子的KM數(shù)值(8.2 μmoldm–3)來(lái)看, 本文制備的固定Lac的CMCHNDMPC納米復(fù)合物對(duì)氧氣的親和力很高, 不但高于文獻(xiàn)6報(bào)道的固酶電極對(duì)氧的親和力(KM= 3.22 mmoldm–3), 而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其對(duì)葡萄糖的親和力(參見(jiàn)Supporting Information (KM= 128.4 mmoldm–3)),這和前述結(jié)論相一致. 根據(jù)圖9還可以粗略計(jì)算出固酶電極化學(xué)結(jié)合氧分子的速率(以氧分子消耗的速率表示), 再根據(jù)電極表面層固定并實(shí)現(xiàn)與導(dǎo)電基體直接電子導(dǎo)通Lac的表面濃度就可以得到歸一化的酶催化氧還原表觀(guān)速率常數(shù)為0.023 s–1, 結(jié)合前述酶-電極間直接電子遷移的速率(0.013 s–1)及分子內(nèi)電子遷移速率(1000 s–1)27,33來(lái)看, 整個(gè)固酶電極催化過(guò)程受限于酶-電極之間電子遷移的速率, 即如何使固定酶分子采取更有利于實(shí)現(xiàn)酶活性中心-導(dǎo)電基體電子遷移的定向鏈接的構(gòu)型將是改善這類(lèi)固酶電極的關(guān)鍵.

圖8 CMCH-NDMPC固酶基葡萄糖/O2生物燃料電池的極化曲線(xiàn)(■)和性能曲線(xiàn)(Δ)Fig.8 Polarization curves (■) and performance curves (Δ) of as-assembled CMCH-NDMPC with entrapped enzyme based glucose/O2biofuel cell

圖9 計(jì)時(shí)電流法表征Lac/CMCH-NDMPC/GC作為電化學(xué)傳感器對(duì)氧傳感的性能Fig.9 Performance for oxygen detection of Lac/CMCHNDMPC/GC as electrochemical sensor characterized by chronoamperometric measurements

4 結(jié) 論

利用成膜劑CMCH和導(dǎo)電基體NDMPC機(jī)械共混所得的納米介孔復(fù)合物作為固酶載體, 制備了兩種固酶電極: Lac/CMCH-NDMPC/GC和GOx/CMCHNDMPC/GC. 系統(tǒng)研究這類(lèi)固酶電極的直接電化學(xué)行為及其對(duì)各自底物的催化性能, 測(cè)試了這類(lèi)電極催化性能重現(xiàn)性, 長(zhǎng)期使用性能, 力學(xué)穩(wěn)定性以及pH耐受性, 評(píng)估了固定Lac電極對(duì)氧分子的電化學(xué)傳感性能; 在此基礎(chǔ)上將兩種固酶電極組裝成為酶燃料電池, 在離子交換膜存在前提下測(cè)試了這一電池的能量輸出性能和長(zhǎng)期使用性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:這種固酶電極可以在無(wú)電子中介情況下實(shí)現(xiàn)Lac活性中心T1與電極之間的有效電子通訊但不能實(shí)現(xiàn)GOx活性中心與電極間的直接電子導(dǎo)通, 而且固定Lac陰極對(duì)氧還原具有良好的催化性能: 氧還原起始電位可達(dá)820 mV, 實(shí)現(xiàn)電子導(dǎo)通的Lac分子占電極表面固定酶分子數(shù)的近1/4, 單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化底物分子速率可達(dá)2.3 × 10–2s–1. 這種固酶電極具有對(duì)氧的檢測(cè)限低(0.04 μmoldm–3), 對(duì)氧的親和力高(KM= 8.2 μmoldm–3), 而且具有更高的對(duì)底物靈敏度(12.1μAμmol–1dm3)之優(yōu)勢(shì). 通過(guò)分析固酶電極催化氧還原動(dòng)力學(xué), 可以判定固酶陰極上催化反應(yīng)過(guò)程受制于酶活性中心T1與導(dǎo)電基體間直接電子遷移的速率. 這種固酶燃料電池能量輸出性能測(cè)試結(jié)果表明其開(kāi)路電壓OCV為0.38 V, 最大輸出能量密度為19.2 μWcm–2, 此電池在使用3 week之后電池的輸出功率密度仍可達(dá)到初始值的60%以上. 如果通過(guò)調(diào)控載體表面化學(xué)結(jié)構(gòu), 載體孔徑和介孔內(nèi)部環(huán)境以實(shí)現(xiàn)酶-電極間電子遷移性能優(yōu)化, 從而實(shí)現(xiàn)燃料及氧化劑同時(shí)被酶充分催化反應(yīng), 此種電池的能量輸出性能將會(huì)有較大程度的提高.

Supporting Information: available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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Performance of Nitrogen-Doped Carbon Nanocomposite with Entrapped Enzyme-Based Fuel Cell

HAYIERBIEK Kulisong ZHAO Shu-Xian YANG Yang ZENG Han*
(Chemistry and Chemical Engineering Academy, Xinjiang Normal University, Urumuqi 830054, P. R. China)

A nanocomposite composed of N-doped mesoporous carbon material (NDMPC) and carboxymethylated chitosan (CMCH) was fabricated by mechanical co-mixing and used as an enzyme matrix. A novel glucose/O2enzymatic biofuel cell was fabricated with a Nafion ion-exchange membrane consisting of a laccase (Lac)-entrapped biocathode and glucose oxidase-incorporated bioanode. Enzyme electrodes were prepared by the dripping coat and air-dried method. The performance of the laccase-based electrode as a biocathode in a fuel cell and an oxygen electro-chemical sensor was characterized by cyclic voltammetry in combination with the rotating disk electrode technique, linear scanning voltammetry (LSV), and chronoamperometry. UV-Vis spectrometry and graphite furnace atomic absorption spectroscopy were used to investigate the configuration of enzyme molecules on the surface of electrode and to evaluate the enzymeloading of the matrix on the electrode interface. The results from the experiments showed that the laccasebased cathode displayed direct electron transfer between the active centre in laccase (T1) and the conductive matrix without any external electron mediators (apparent electron transfer rate 0.013 s–1). A minor overpotential for oxygen reduction (150 mV) was also observed. Through further comparison of the intra-molecule electron relay rate (1000 s–1), substrate turnover frequency (0.023 s–1), and previous enzyme-conductive matrix electron transfer rate, quantitative analysis showed that the latter was the rate-determining step in the whole catalytic cycle of the oxygen reduction reaction. This laccase-based electrode as an oxygen electrochemical sensor for detecting oxygen showed a low detection limit (0.04 μmoldm–3), high sensitivity (12.1 μAμmol–1dm3), and affinity for oxygen (KM= 8.2 μmoldm–3). This laccase-based cathode also had advantages such as excellent reproducibility, long-term usability, thermal stability, and pH endurance. The results for the fabricated biofuel cell showed an open circuit voltage of 0.38 V and a maximal energy output density of 19.2 μWcm–2, maintaining greater than 60% of the initial value even after continuous work for 3 weeks under optimal conditions.

Laccase; Nitrogen-doped meso-porous carbon material; Carboxymethylated Chitosan; Direct electron transfer; Oxygen reduction reaction; Electrochemical sensor; Bio-fuel cell

O643.3

10.3866/PKU.WHXB201506231

Received: March 31, 2015; Revised: June 23, 2015; Published on Web: June 23, 2015.

*Corresponding author. Email: zenghan1289@163.com; Tel: +86-991-4332279.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (21363024), Ph. D. Scientific Initiate Funding Project of Xinjiang Normal University, China (XJNUBS1228), and Xinjiang Autonomous Region 2013 Annual Colleges and Universities Scientific Research Plan-Young Teacher Cultivation Project, China (XJEDU2013S29).

國(guó)家自然科學(xué)基金(21363024), 新疆師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(XJNUBS1228)及新疆維吾爾自治區(qū)2013年度高校科研計(jì)劃青年教師培育項(xiàng)目(XJEDU2013S29)資助

? Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica