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溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院手外科，浙江溫州325000

周圍神經(jīng)端側(cè)縫合后再生軸突PSA-NCAM的表達(dá)及對(duì)趨化性的影響

虞慶蔣良福丁健李志杰王安遠(yuǎn)陳一衡李士林康

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院手外科，浙江溫州325000

目的觀察端側(cè)縫合后再生軸突表面唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）分子的表達(dá)，及其對(duì)趨化性的影響。方法雌性清潔級(jí)SD大鼠24只，分4組，正常對(duì)照組、端側(cè)縫合組、電刺激組和PSA拮抗劑組。3個(gè)月后進(jìn)行電生理檢測(cè)，免疫組化檢測(cè)再生軸突PSA-NCAM表達(dá)，肌肉組織學(xué)檢測(cè)，神經(jīng)元逆行熒光示蹤觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例。結(jié)果正常組不表達(dá)PSA-NCAM，電刺激組明顯高于端側(cè)組（P＜0．05)，拮抗劑組與端側(cè)組無顯著差異。端側(cè)組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例為16．54%，短暫電刺激后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例上升至29．25%（P＜0．05）。拮抗劑組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例與端側(cè)組無顯著差異。結(jié)論端側(cè)縫合再生的神經(jīng)趨化性與再生軸突表面PSA-NCAM表達(dá)量相關(guān)，提高軸突PSA-NCAM的表達(dá)有助于改善再生神經(jīng)的趨化性。

周圍神經(jīng)；神經(jīng)再生；端側(cè)縫合；唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子

周圍神經(jīng)端側(cè)縫合指將斷離的周圍神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)斷端，縫接在附近完整神經(jīng)干的側(cè)面，為神經(jīng)修復(fù)提供了新的方法。我們?cè)谇捌诠ぷ髦凶C實(shí)了端側(cè)縫合能有效促進(jìn)神經(jīng)再生[1,2]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)再生神經(jīng)在趨化性方面表現(xiàn)不明顯。我們推測(cè)是由于側(cè)方出芽時(shí)的新生軸突缺少引導(dǎo)特異性生長的識(shí)別分子。唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM)是近年來發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)識(shí)別分子，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)發(fā)育、損傷神經(jīng)肌肉再支配中起到重要作用[3]。本研究將觀察端側(cè)縫合后再生軸突表面PSA-NCAM分子的表達(dá)及其對(duì)趨化性的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2013年9～12月間選取由溫州醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康雌性SD大鼠24只作為研究對(duì)象，均為體重230～250 g的健康清潔級(jí)大鼠。將上述大鼠置于室溫18℃～22℃、濕度60%～70%、通風(fēng)良好的同一清潔飼養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

將24只小鼠隨機(jī)分為四組：正常組（n=6）、實(shí)驗(yàn)組[端側(cè)縫合組（n=6）、電刺激組（n=6）和PSA拮抗劑組（n=6）]。①端側(cè)縫合組SD大鼠應(yīng)用1%戊巴比妥鈉（5 mg/100 g）腹腔麻醉后，固定，局部消毒，脫毛，沿上臂縱軸切開皮膚，顯露深部肌皮神經(jīng)，在肌皮神經(jīng)根部切斷。顯露尺神經(jīng)，用顯微鑷在其內(nèi)后方撕開1 mm長的外膜，10倍顯微鏡下將肌皮神經(jīng)與尺神經(jīng)用“11-0”縫線作端側(cè)縫合。②電刺激組在同樣操作后，縫合口近端尺神經(jīng)予短暫電刺激（20 Hz，1 h，意大利ESAOT公司的Reporter四道程肌電誘發(fā)電位儀）。③PSA拮抗劑組在神經(jīng)端側(cè)縫合并進(jìn)行短暫電刺激后，縫合口局部應(yīng)用PSA-NCAM的拮抗劑0．5 μL Endoneuraminidase-N（8．7 U/μL，上海，博奧派克生物）。④正常組顯露肌皮和尺神經(jīng)后，重新縫合關(guān)閉傷口。

1.3觀察指標(biāo)

各組大鼠飼養(yǎng)3個(gè)月后，重新麻醉，固定，進(jìn)行電生理及組織學(xué)檢測(cè)。

1．3．1電生理檢測(cè)使用意大利ESAOT公司的Reporter四道程肌電誘發(fā)電位儀記錄肱二頭肌肌電圖。在同一位置將刺激電極置于肌皮神經(jīng)下方，肱二頭肌肌腹飽滿出插入同心針記錄電極。使用3．20 mA的電流強(qiáng)度，0．5 ms的電流脈寬，刺激頻率為2 Hz。

1．3．2檢測(cè)再生軸突PSA-NCAM表達(dá)情況顯露神經(jīng)縫合處，正常組距肌皮神經(jīng)根部5 mm，實(shí)驗(yàn)組距縫合點(diǎn)遠(yuǎn)端5 mm處取肌皮神經(jīng)，均長約3 mm。常規(guī)給予10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片后采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照說明書中的操作步驟進(jìn)行操作。采用美國IPP6．0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)PSA-NCAM免疫組化結(jié)果中的光密度值進(jìn)行測(cè)定。

1．3．3肌肉組織學(xué)檢測(cè)將肱二頭肌經(jīng)10%甲醛固定，酒精脫水，石蠟包埋。在肌腹中部同樣水平橫向切片，厚5 pan，HE染色，LeicaDWLB2型顯微鏡觀察，Leica FW4000圖像分析軟件測(cè)量肱二頭肌肌纖維截面積。

1．3．4神經(jīng)元逆行熒光示蹤顯露臂叢神經(jīng)束支部，放大10倍顯微鏡下用1 μL微量注射器于實(shí)驗(yàn)組肌皮神經(jīng)外膜下注射1 μL 3%Fluoro-Gold水溶液（Sigma公司，美國）。FG熒光染色3 d后，動(dòng)物重新麻醉、固定后，通過心臟灌注多聚甲醛液體，背側(cè)入路顯露脊髓，完整切取頸5到胸1節(jié)段脊髓及背根神經(jīng)節(jié)，固定并脫水后，行連續(xù)冰凍切片（Leica冰凍切片機(jī)，德國），用熒光顯微鏡（LeicaDWLB2型，德國）觀察，熒光濾鏡激發(fā)波長為330～380 nm，在這個(gè)激發(fā)波下神經(jīng)元胞漿肉的Fluoro-Gold顯示黃白色熒光（波長440 nm）。通過圖像處理系統(tǒng)計(jì)數(shù)各組的前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及背根感覺神經(jīng)元。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Stata 7．0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，設(shè)定可信水平95%。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組差異采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1電生理檢測(cè)

端側(cè)組肱二頭肌CMAP最大波幅為正常對(duì)照組的28．59%，電刺激組為端側(cè)組的2．24倍，經(jīng)單因素方差分析各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19．53，P＜0．01）。端側(cè)組肱二頭肌CMAP潛伏期較正常組減慢86．46%，電刺激組為端側(cè)組的69．27%，經(jīng)單因素方差分析各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70．47，P＜0．01），見表1。

表1　肱二頭肌CMAP最大波幅與潛伏期（x±s，n=6）

2.2各組PSA-NCAM的表達(dá)

對(duì)各組由免疫組化測(cè)得的光密度值進(jìn)行比較，正常組不表達(dá)PSA-NCAM，經(jīng)單因素方差分析各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=95．69，P＜0．01），見表2。

2.3肌肉組織學(xué)檢測(cè)

端側(cè)組肱二頭肌纖維橫截面積為正常組的82．97%，經(jīng)單因素方差分析各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4．78，P＜0．05），見表2。

表2　各組神經(jīng)PSA-NCAM的表達(dá)（光密度值）和肱二頭肌纖維截面積（x±s，n=6）

2.4實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元逆行熒光示蹤

電刺激組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目增加，經(jīng)單因素方差分析各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78．87，P＜0．01）。各組感覺神經(jīng)元差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0．14，P＞0．05）。神經(jīng)元總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13．9，P＜0．01），見表3。在各組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目中，端側(cè)組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例為16．54%，電刺激組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例上升至29．25%，拮抗劑組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例減至18．21%。

表3　實(shí)驗(yàn)組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目及比例（x±s，n=6）

3　討論

周圍神經(jīng)端側(cè)縫合為我們提供了神經(jīng)長段缺損修復(fù)的新方法，是指將斷離的周圍神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)斷端，縫接在附近完整神經(jīng)干的側(cè)面。與傳統(tǒng)神經(jīng)端端縫合比較具有的優(yōu)點(diǎn)包括：①對(duì)供體神經(jīng)影響很??；②縮短神經(jīng)再生時(shí)間，可以選擇距損傷神經(jīng)靶器官較近的完整神經(jīng)作為供體神經(jīng)；③操作簡(jiǎn)便。

大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了周圍神經(jīng)端側(cè)縫合的有效性[4,5]，但是臨床報(bào)道各家不一。Millesi等[6]報(bào)告9例臂叢上干損傷應(yīng)用膈神經(jīng)、副神經(jīng)、肩胛背神經(jīng)以端側(cè)方法分別移位至胸前內(nèi)側(cè)神經(jīng)、肩胛上神經(jīng)及腋神經(jīng)，結(jié)果8例相應(yīng)肌力恢復(fù)達(dá)M3以上，僅1例肌力恢復(fù)為M2。而Pienaar等[7]報(bào)道10例患者，16個(gè)月后運(yùn)動(dòng)感覺均無明顯恢復(fù)。因此有必要進(jìn)一步研究周圍神經(jīng)端側(cè)縫合后神經(jīng)再生規(guī)律，從而提高功能恢復(fù)效果。

周圍神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素是再生神經(jīng)纖維能否特異性地長入對(duì)應(yīng)的靶器官，Hoke等[8]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維再生軸突有傾向性地長入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)到達(dá)肌組織而非皮膚，此即傾向性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再支配（preferential motor reinnervation，PMR）現(xiàn)象。神經(jīng)趨化性是解決周圍神經(jīng)再生后選擇性再生的希望和關(guān)鍵。目前認(rèn)為影響周圍神經(jīng)趨化性的因素包括[9]：①遠(yuǎn)端的神經(jīng)纖維通道；②靶器官分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子；③近端的神經(jīng)元胞體。

PSA-NCAM是一類介導(dǎo)黏附的膜表面糖蛋白，主要存在于胚胎發(fā)育期，在神經(jīng)元發(fā)育中起重要作用，可能與突觸的重排和可塑性有關(guān)。在成年期，PSANCAM的表達(dá)限制在保留可塑性的區(qū)域?，F(xiàn)已證明PSA-NCAM介導(dǎo)的作用能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)的激活，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長分化、軸突出芽、突觸修飾和神經(jīng)信號(hào)傳遞都發(fā)揮了重要作用，同時(shí)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)發(fā)育、損傷神經(jīng)肌肉再支配中起到重要作用。Franz等[10]研究表明，損傷后再生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸突表面PSA-NCAM呈高表達(dá)，同時(shí)PSA-NCAM的高表達(dá)對(duì)再生神經(jīng)趨化性是必須的。

我們研究小組在前期工作中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)端側(cè)縫合后再生神經(jīng)趨化性不明顯[1,2]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)端側(cè)縫合后再生軸突表面表達(dá)PSA-NCAM，短暫電刺激能顯著提高PSA-NCAM的表達(dá)，同時(shí)短暫電刺激能提高端側(cè)縫合再生神經(jīng)趨化性，局部應(yīng)用PSA拮抗劑后再生神經(jīng)趨化性下降。這些結(jié)果初步表明端側(cè)縫合再生的神經(jīng)趨化性與軸突表面PSA-NCAM的表達(dá)相關(guān)，提高軸突PSA-NCAM的表達(dá)有助于改善再生神經(jīng)的趨化性。

綜上所述，周圍神經(jīng)損傷是臨床常見疾病，不僅給患者帶來了巨大的痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我們的研究將進(jìn)一步揭示周圍神經(jīng)端側(cè)縫合后神經(jīng)再生的規(guī)律，為臨床提高周圍神經(jīng)修復(fù)效果提供新的途徑。

[1]虞慶，王濤，顧玉東.神經(jīng)端側(cè)縫合后趨化性的神經(jīng)元逆行示蹤研究[J].中華顯微外科雜志，2009，32（1）：36-38.

[2]虞慶，王濤，羅鵬波，等.周圍神經(jīng)端側(cè)縫合后神經(jīng)再生及其趨化性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華手外科雜志，2007，23（1）：30-33.

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PSA-NCAM expression of peripheral nerve regeneration axon after endto-side neurorrhaphy and the influence on chemotaxis

YU QingJIANG LiangfuDING JianLI ZhijieWANG AnyuanCHEN YihengLI ShiLIN Kang
Department of Orthopaedics,the Second Affiliated Hospital&Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou325000,China

Objective To examine the expression of PSA-NCAM and neurotropism after end-to-side neurorrhaphy．Methods A total of 24 female Sprague-Dawley rats were divided into 4 groups,normal group,end-to-side neurorrhaphy group,electrical stimulation group and PSA antagonist group．Post operation,electrophysiology,histology of the muscle,PSA-NCAM stain and retrograde Fluoro-Gold neuron tracing after three months were conducted．Results Normal group did not express PSA-NCAM,it showed that in the electrical stimulation group,PSA-NCAM was higher than end-to-side group(P＜0．05),antagonists and end-to-side group had no significant difference．Retrograde neuron tracing demonstrated that motor neuron counts in electrical stimulation group was 29．25%,higher than end-to-side group (16．54%,P＜0．05)．Motor neuron proportion in antagonist group and end-to-side group had no significant difference．Conclusion Neurotropism after end-to-side neurorrhaphy is related with PSA-NCAM expression．Therapeutics aimed at increasing PSA-NCAM levels on regenerating motor axons may lead to superior funtional outcomes．

Peripheral nerves;Nerve regeneration;End-to-side neurorrhaphy;Polysialic acid-neural cell adhesion molecule

R73-3

A

1673-9701（2015）07-0014-03

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12H06005）

（2014-05-05）