張 朋王金慶周 勇紀(jì)志鵬孟祥瑞葛運(yùn)飛丁印魯

趨化因子受體CCR6及其配體CCL20與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究

張 朋①王金慶①周 勇①紀(jì)志鵬①孟祥瑞①葛運(yùn)飛①丁印魯①

目的：探討人趨化因子受體6（CCR6）及其配體CCL20的表達(dá)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法：選擇2012年10月-2014年10月在本院行結(jié)腸癌根治術(shù)的患者93例作為研究對象，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測93例患者的結(jié)腸癌組織、正常腸黏膜組織及其中14例結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組織、肝轉(zhuǎn)移灶旁肝組織中CCL20及CCR6 mRNA表達(dá)情況，分析比較其差異。結(jié)果：CCR6及CCL20 mRNA在結(jié)腸癌和肝轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，并且均顯著高于癌旁組織，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)腸癌組織中CCR6及CCL20 mRNA表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小及組織學(xué)類型無明顯關(guān)系（P＞0.05），與TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：CCR6及其配體CCL20可能參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌向肝臟特異性轉(zhuǎn)移過程。

趨化因子； 人趨化因子受體6； CC亞族趨化因子配體20； 結(jié)腸癌； 肝轉(zhuǎn)移

結(jié)腸癌總發(fā)病率在歐美等發(fā)達(dá)國家占惡性腫瘤的第3位[1]。我國雖較發(fā)達(dá)國家發(fā)病率低，但近年有明顯上升趨勢[2]。其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要通過血管與淋巴管的機(jī)械運(yùn)輸作用，近年來研究結(jié)果顯示趨化因子參與了腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-5]。本研究檢測93例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)的肝轉(zhuǎn)移組織中CCR6、CCL20 mRNA的表達(dá)，探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員CCR6及其配體CCL20在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月-2014年10月本院普外科收治的結(jié)腸癌根治術(shù)后患者93例作為研究對象，均經(jīng)病理證實(shí)結(jié)腸癌。其中男49例，女44例；年齡29～86歲，中位年齡67歲；TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期39例，Ⅲ期28例，Ⅳ期19例，其中14例發(fā)生結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。術(shù)后病理組織學(xué)類型包括：高中分化腺癌69例，低分化腺癌24例。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) （1）手術(shù)根治切除后病理診斷結(jié)腸癌；（2）美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）的TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期；（3）手術(shù)方式包括開腹及腹腔鏡結(jié)腸癌根治術(shù)，包括右半結(jié)腸、橫結(jié)腸、左半結(jié)腸切除術(shù)，行常規(guī)淋巴結(jié)清掃；（4）手術(shù)前未接受放化療和生物治療并且簽署知情同意書。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器與試劑 RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kits（德國Qiagen公司）；TaqMan2×PCR Master Mix、GeneAmp7900 Sequence Detection Systems（美國Applied Biosystems公司），DNA系列分析儀（美國Applied Biosystems公司）；流式細(xì)胞儀、QPREP標(biāo)本處理儀（美國Coulter公司）；藻紅素（PE）標(biāo)記鼠抗人CCR6單抗（美國eBioscience公司）。

1.3.2 組織標(biāo)本的準(zhǔn)備 所有標(biāo)本均于手術(shù)切除腫瘤后10～25 min內(nèi)采集，結(jié)腸癌組織以及鄰近正常腸黏膜組織（距腫瘤邊緣大于5 cm），肝轉(zhuǎn)移患者取肝轉(zhuǎn)移灶及灶旁肝組織，所得標(biāo)本立即置于液氮中保存。

1.3.3 總RNA的提取及單鏈cDNA的合成 取結(jié)腸癌組織75 mg，以液氮研磨，加1 mL Trizol混勻，15～30℃靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，充分振蕩15 s，15～30℃靜置3 min。12 000 r/min離心15 min，取上清，加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，15～30℃靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀中加入75%的乙醇，混勻，7500 r/min離心5 min后棄上清，室溫放置晾干。加適量的DEPC溶解。用紫外分光光度計(jì)測定其純度及濃度后，取3 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄用20 μL體系，包括2 μL 10×RT mix，2μL dNTP，2μL Oligo（dt），1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，最后用DEPC液補(bǔ)至20 μL[6]。

1.3.4 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板用無菌去離子液稀釋至300 μL，取5 μL為PCR模板。CCR6引物：上游5’-GGT CAA CTT TAA CTG TGG GAT G-3’，下游5’-GGT GTA GGC GAG GAC TTT CT-3’。CCL20引物：5’-AGC AGC AAG CAA CTA CGA CT-3’，下游5’-TCT TAG GCT GAG GAG GTT CA-3’。GAPDH引物上游：5’-ATG GGA AGC TGG TCA TCA AC-3’，下游：5’-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3’。PCR反應(yīng)體系：2.5×SYBR 11.25 μL，上下游引物（10 μL/L）各1.25μL，模板5 μL，其余用無菌去離子液補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，收集溶解曲線。計(jì)算CCL20和CCR6基因相對于GAPDH的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，正態(tài)分布的資料比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料用Mann-Whitney U-test進(jìn)行檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織CCR6、CCL20 mRNA表達(dá)情況比較 CCR6、CCL20 mRNA在結(jié)腸癌組織及肝臟轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)量高于正常黏膜組織及肝轉(zhuǎn)移灶旁組織，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同組織CCR6、CCL20 mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表1 不同組織CCR6、CCL20 mRNA表達(dá)情況比較（±s）

CCL20 mRNA相對表達(dá)量正常黏膜組織（n=93）0.625±0.1820.754±0.074大腸癌組織（n=93）3.134±0.1962.006±0.044肝轉(zhuǎn)移組織（n=14）3.537±0.1682.182±0.128肝轉(zhuǎn)移灶旁組織（n=14）0.594±0.2420.783±0.122組織類型CCR6 mRNA相對表達(dá)量

2.2 CCR6、CCL20 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病例特征的關(guān)系 CCR6、CCL20 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小及組織學(xué)分級無相關(guān)性（P＞0.05），與結(jié)腸癌的TNM分期相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 CCR6、CCL20 mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病例特征的關(guān)系

3 討論

趨化因子是一單鏈小分子蛋白質(zhì)超家族，通過與受體的相互作用，引起靶細(xì)胞的定向遷移[7]。大多數(shù)趨化因子有4個特征性的保守的半胱氨酸（Cys），根據(jù)靠近分子氨基端（N端）的前2個Cys之間是否插入其他氨基酸，將它們分為4類：CXC類（如IL-8）、CC（如MCP-1）；CX3C類（如Fractalkine）及C類（如Lymphotactin）[8]。趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的G蛋白偶連的跨膜受體（GPCR）。按趨化因子的分類，分為CC類受體（CCR）、CXC類受體（CXCR）、CX3C和C類受體（CX3CR、CR）[9]。趨化因子受體CCR6是趨化因子CCL20（又稱巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)蛋白-3α，MIP-3α）的專屬受體（specific receptors），二者構(gòu)成一個與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移有密切關(guān)系的生物學(xué)軸，其實(shí)質(zhì)在于CCR6對其配體CCL20的高度親和力和絕對特異性。目前關(guān)于CCR6在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用的研究尚處于起始階段。Andre等[10]研究顯示CCR6高表達(dá)與乳腺癌的胸膜轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移相關(guān)；Rubie等[11]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中CCR6與CCL20表達(dá)高于正常肝臟組織。胰腺癌組織存在趨化因子CCL20及其受體CCR6 mRNA的表達(dá)，CCL20可以顯著促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞株COLO-357的增殖和遷移[12]。CCL20還能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1侵襲，CCR6抗體可以阻斷CCL20對胰腺癌細(xì)胞的促侵襲作用。正常肝組織和肝細(xì)胞癌組織中均有CCL20及CCR6表達(dá)，但癌組織中CCL20及CCR6表達(dá)顯著升高[13]。CCR6尤其高表達(dá)于癌組織侵襲的前沿部分，這有助于表達(dá)CCR6的癌細(xì)胞在CCL20信號刺激下向周邊浸潤生長。

與正常結(jié)直腸組織相比，趨化因子受體CXCR4、CCR6、CCR7在結(jié)直腸癌原發(fā)瘤中均表達(dá)升高，但在肝轉(zhuǎn)移瘤中僅CXCR4、CCR6升高；與食道、胃、結(jié)直腸等組織比較，肝臟組織中CCL12、CCL19、CCL21表達(dá)均無明顯改變，而CCL20在肝組織中表達(dá)卻明顯升高，提示在肝臟分泌的CCL20誘導(dǎo)下，高表達(dá)CCR6的結(jié)直腸癌細(xì)胞可以發(fā)生定向遷移進(jìn)而形成肝轉(zhuǎn)移[14]。

CCR6、CCL20在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，CCR6在多數(shù)肝轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)高于鄰近正常肝組織。Ghadjar等[15]對64例結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，CCR6高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移，CCR6表達(dá)程度是預(yù)測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立因子。

本研究結(jié)果表明，CCR6、CCL20 mRNA在結(jié)腸癌及肝轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)較相應(yīng)的癌旁組織顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CCL20、CCR6 mRNA的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大?。═分期）、病理類型無明顯相關(guān)性（P＞0.05），與TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05），提示CCL20、CCR6軸與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果不僅為結(jié)腸癌患者預(yù)后的判斷提供了參考，而且為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)防和臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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Experimental Study of the Relationship between Human Chemokine Receptor 6，CC Chemokine Ligand 20 and Liver Metastasis of Colorectal Cancer

ZHANG Peng，WANG J in-qing，ZHOU Yong，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（23）：049-052

Objective：To investigate the relationship between CCR6，CCL20 and liver metastasis of colorectal cancer. Method：93 patients who received radical operation for carcinoma of colon in our hospital from October 2012 to October 2014were selected as the research objects.The expression situation of CCR6，CCL20 mRNA in 93 patients’ colorectal cancer tissues，normal mucosa tissues and 14 patients’ colorectal liver metastases tissues，adjacent nontumorous liver tissues was examined by real-time fluorescent quantitative PCR.The differences among them were analyzed and compared.Result：The expression of CCR6，CCL20 mRNA in colorectal cancer tissues and metastatic liver focus were significantly higher than in the adjacent tissues，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expression of CCR6，CCL20 mRNA in colorectal cancer tissues had no significant correlation with the patients’ sex，age，tumor size and pathological types（P＞0.05），but it had a relationship with TNM-staging（P＜0.05）.Conclusion：CCR6 and CCL20 may take part in the regulation of colorectal liver metastasis.

Chemokine； Human chemokine receptor 6； CC chemokine ligand 20； Colorectal cancer； Liver metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.23.017

2015-05-03） （本文編輯：王利）

①山東大學(xué)第二醫(yī)院 山東 濟(jì)南 250033

丁印魯

First-author’s address：The Second Hospital of Shandong University，J i’nan 250033，China