劉百戰(zhàn)，鄭賽晶，高蕓, 朱曉蘭

1 上海煙草集團有限責(zé)任公司煙草行業(yè)卷煙煙氣重點實驗室, 上海, 200082；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥, 230052

煙草與煙氣化學(xué)

13C CP/MAS NMR光譜法分析煙草果膠的含量和結(jié)構(gòu)

劉百戰(zhàn)1，鄭賽晶1，高蕓2, 朱曉蘭2

1 上海煙草集團有限責(zé)任公司煙草行業(yè)卷煙煙氣重點實驗室, 上海, 200082；2 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥, 230052

采用CP/MAS13C NMR光譜法分析煙草果膠的含量和結(jié)構(gòu)。對煙草果膠進行了優(yōu)化提取后，再對其13C NMR光譜圖C-6吸收峰區(qū)域進行了詳細研究，用于計算果膠中半乳糖醛酸（GalA）、甲酯度（DM）和乙酰度（DA）的含量，并就建立的定量方法與經(jīng)典的色譜法和重量法進行了比較。結(jié)果表明，CP/MAS13C NMR光譜法測定煙草樣品中果膠的含量是可靠的，化學(xué)位移和峰面積可用來計算煙草果膠分子的組成、甲酯度和乙酰度，同步實現(xiàn)煙草中果膠的含量和結(jié)構(gòu)分析。

煙草；果膠；NMR光譜；結(jié)構(gòu)分析

果膠是植物所特有的細胞壁組分，屬于多糖類碳氫化合物。烤煙煙葉中果膠含量一般可達6%～7%[1]。果膠是親水膠體物質(zhì)，對煙葉的吸濕性和彈性有一定的作用。果膠含量高的煙葉，對空氣濕度的變化較敏感?？諝庀鄬穸雀邥r，煙葉吸濕變軟，甚至導(dǎo)致起熱、發(fā)霉；空氣相對濕度低時，煙葉變硬變脆，容易破碎[2]。

對于煙草吸味質(zhì)量來說，果膠質(zhì)是一種不利的化學(xué)成分。果膠發(fā)酵生成多達1%～1.5%的乙酸，乙酸有辛辣和刺激味。果膠質(zhì)在燃吸過程中可產(chǎn)生甲醇，甲醇再進一步氧化為甲醛、甲酸等成分，不僅會給煙氣帶來刺激性，而且不利于吸煙的安全性，同時較高的果膠質(zhì)含量還會導(dǎo)致卷煙焦油量升高。因此，煙草中果膠含量的測定已成為煙草品質(zhì)評價重要指標之一[3]。煙草中的果膠的測定常用EDTA提取果膠, 然后用重量法、容量法測定, 或者將果膠水解成半乳糖醛酸后用咔唑顯色測定[4]。2010年行業(yè)以離子色譜法[5]作為測定煙草果膠的標準方法，采用酸化后使用果膠酶分別酶解酸化液和殘渣，酶解液通過離子交換分離后，電化學(xué)檢測器定量測定半乳糖醛酸。這些方法大多操作比較繁瑣，且都需要進行酸解或酶解，對煙草中果膠的結(jié)構(gòu)沒有涉及，對果膠結(jié)構(gòu)中的甲酯化度和乙酰度也鮮有研究[6]。

交叉極化結(jié)合魔角旋轉(zhuǎn)13C核磁共振法（CP/MAS13C NMR）技術(shù)由于能夠直接采用固體粉末定量地估計其化學(xué)組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)，對其組分不必進行分離和溶解等處理就可以直接測定而獲得可靠的結(jié)構(gòu)信息，已經(jīng)成為研究高分子化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)最重要的工具之一[7-8]。溶液核磁雖然具有高靈敏度，對于果膠分子而言，雖溶于水，但其溶液粘度非常大，這限制了溶液核磁的使用[7]。本研究采用交叉極化結(jié)合魔角旋轉(zhuǎn)13C 固態(tài)核磁共振法結(jié)合光譜擬合技術(shù)研究建立煙草中果膠大分子的分析檢測新方法，分析果膠大分子的微觀結(jié)構(gòu)，對于進一步研究其對煙草的吸濕性能的影響，改善煙葉的評吸質(zhì)量，提高煙葉和煙梗的使用價值，降低生產(chǎn)成本，具有重要應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

HHS11- 2 恒溫水浴鍋、定時電動攪拌器、JA2003 電子天平、101- 1 型烘箱、PHS3C 型精密pH計、FZ102 型植物粉碎機。硫酸鐵銨、活性炭、硫酸鋁鉀、鹽酸、氨水、無水乙醇、硫酸鋁, 均為分析純。由0.2 mol/ L硫酸鐵銨和飽和硫酸鋁鉀溶液組成混合鹽溶液。

儀器：AVANCE AV 400 spectrometer超導(dǎo)傅立葉數(shù)字化核磁共振譜儀(瑞士布魯克)。

不同類型的煙樣經(jīng)40℃烘4小時后粉碎而得。聚半乳糖醛酸(PGA)、聚半乳糖醛酸鈉(PGASS)和六甲苯(HMB)購自上海百靈威化學(xué)品公司，果膠酸鈉、果膠樣品及其衍生物用于樣品分析。

1.2 果膠的提取及純化[9]

稱取10 g 煙末放入燒杯中, 加水100 mL超聲30 min, 抽濾, 用溫度小于40℃的溫水洗滌2 次，洗去果渣中的可溶性糖分及部分色素類物質(zhì)。取濾渣置于燒杯中, 加入稀硫酸溶液,調(diào)pH 值后, 在一定溫度下攪拌萃取一段時間, 抽濾。提取液用1 M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值（3.5）,接著用1:1乙醇沉降后離心，再依次用純乙醇、丙酮和乙醇分別洗滌和沉降后，40℃真空干燥恒重后研磨成粉末，過100目篩，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 果膠含量的測定

水分含量的測定是在110 ℃干燥24h，果膠的得率均以煙葉干重計算。果膠中聚半乳糖醛酸含量的測定是采用CP/MAS13C NMR光譜分析。一級定標用四甲基硅烷(CH3)4Si。13C CP/MAS NMR光譜化學(xué)位移、光譜峰面積及在δ166-190ppm的分解峰形擬合的計算是采用MestReNova 6.1.1核磁軟件進行分析，峰形分解的結(jié)果用來計算果膠的組成、甲酯度和乙酰度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CP/MAS 13C NMR儀器參數(shù)條件的優(yōu)化

果膠中聚半乳糖醛酸含量的測定是采用CP/MAS13C NMR光譜分析。實驗中對測試條件進行了優(yōu)化，最終確立了條件：場強9.40 T，4 mm魔角探頭，轉(zhuǎn)速15 kHz，脈沖寬度90°，交叉極化時間4 μs，接觸時間2 ms，采樣時間34 ms，采樣間隔時間2.0 s，掃描次數(shù)：1024，譜寬300 ppm,一級定標用四甲基硅烷(CH3)4Si。

在優(yōu)化好的儀器實驗參數(shù)條件下，以聚半乳糖醛酸標準樣品測定果膠樣品的核磁共振波譜。如圖1所示，化學(xué)位移δ172 ppm處對應(yīng)的為果膠分子中C-6區(qū)。該峰的位置穩(wěn)定、干擾少、峰面積與果膠分子中的聚半乳糖醛酸及其衍生物(COOH、COO-&COOCH3)的存在量呈良好的線性關(guān)系，可實現(xiàn)煙草樣品中果膠的固態(tài)定量分析[10]。對果膠分子13C CP/MAS NMR光譜圖中的吸收峰所對應(yīng)的化學(xué)位移歸屬如表1示。表中STD2是購自Sigma.公司的檸檬果膠制備的聚半乳糖醛酸鈉鹽，聚半乳糖醛酸的含量超過75 %，與STD1（PGA）相比，純度略低。樣品1和樣品2 均為從煙草中提取的果膠樣品。

圖1 . 聚半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸鈉和煙草提取果膠樣品的13C CP/MAS NMR光譜圖Fig.1 13C CP/MAS NMR spectra of PGA, PGASS and pectin samples extracted from tobacco

表1 果膠分子CP/MAS 13C NMR光譜的化學(xué)位移歸屬Tab. 1 CP/MAS 13C NMR chemical shifts (in ppm) for polygalacturonic acid and pectins.

2.2 果膠的提取條件的優(yōu)化

果膠的提取過程對果膠的得率和最終果膠分子聚半乳糖醛酸的含量及結(jié)構(gòu)都有深刻的影響[11]，因此，提取條件的優(yōu)化也是果膠分析中關(guān)鍵性因素，通常果膠可以用冷水/熱水、緩沖溶液、冷/熱的螯合試劑、熱稀酸或稀堿液等從植物的細胞壁中提取分離，采用熱酸提取果膠的產(chǎn)率最高，也是工業(yè)上最方便的提取方法之一[12]。實驗中采用了正交實驗方案對酸提取煙草果膠的主要條件（pH 值，溫度和時間）進行了優(yōu)化，各條件下果膠的得率和樣品中聚半乳糖醛酸的含量如表2所示。

表2 酸提取條件（pH 值、溫度和時間）對果膠得率和純度的影響Tab. 2 Effect of pH value, temperature and heating time on the average recovery of pectin yields and purity from acid extraction tobacco sample (n = 3 )

以各項條件下的果膠得率和果膠分子中聚半乳糖醛酸的含量的三次水平分別求平均值后對應(yīng)于各條件和水平作圖如圖2所示。從圖中可見，不同pH值對提取的果膠的得率有顯著影響，在pH值范圍為1.5—2.5，果膠的平均產(chǎn)率差別較大，為4.61%—10.38 %(%w/w)。在酸性較弱（pH 2.5）時，可能會有部分果膠不能被完全水解，果膠的產(chǎn)率最低。隨酸強度的增加果膠產(chǎn)率增加，但是高酸度也有可能會使雜質(zhì)（如纖維素、半纖維素等）在酸性條件下發(fā)生水解造成得率的提高[13]，并不代表果膠的純度高，實際上pH 值為2，提取的果膠中聚半乳糖醛酸的含量明顯比pH為1.5時高。溫度對果膠的提取率有明顯影響，溫度越高，果膠的得率越高，同時果膠中聚半乳糖醛酸的含量也越高[14]。如圖所示，95℃提取的果膠中聚半乳糖醛酸的含量總比85℃和75℃高，但也有文獻[15]表明，水解溫度超過90℃以上，也會造成部分果膠水解。時間對果膠的提取率的影響沒有前兩項因素那樣明顯，時間延長到1.0 h以上，果膠的提取率增加速度減緩，長時間維持在酸性條件下也會使果膠的得率和酯化度下降。因此，綜合考慮酸提取煙草果膠的主要條件為pH 值2.0，溫度85℃和時間1.5h，在此條件下，測定的煙草樣品中果膠的含量為7.91%（以聚半乳糖醛酸計）。

圖2 酸解主要條件（pH 值，溫度和時間）對果膠得率和純度的影響Fig. 2 Effects of pH value, temperature and time on the yield and purity of pectin in tobacco acid hydrolysis

2.3 煙草果膠定量方法評價

采用稀酸提取煙草果膠，制備得CP/MAS13C NMR光譜分析的煙草果膠樣品。考慮到內(nèi)標添加的包合性及放置位置的重現(xiàn)性不好會嚴重影響NMR光譜信號的強度，實驗中選擇了外標法定量[16]。在優(yōu)化好的儀器實驗參數(shù)條件下，稱取系列聚半乳糖醛酸標準樣品(10-80 mg，裝不滿時以NaCl固體裝填，并與樣品混勻)，裝入4 mm魔角探頭，制備相應(yīng)的13C NMR譜，以C-6δ166-177 ppm區(qū)積分面積與樣品中聚半乳糖醛酸含量建立線性關(guān)系，具體方程為A=645.39×m-339.28 (R2=0.9996)，顯示果膠分子中的聚半乳糖醛酸的質(zhì)量在測定范圍內(nèi)線性良好，因此由果膠樣品13C NMR光譜中δ（166-177 ppm）吸收峰面積得出聚半乳糖醛酸量，換算出果膠含量。

為驗證13C CP/MAS NMR光譜方法的準確性，實驗中對兩種煙草樣品提取的果膠樣品采用聚半乳糖醛酸標準樣品分兩種份量添加后進行13C CP/MAS NMR光譜分析，每樣重復(fù)測定聚半乳糖醛酸含量三次，以驗證方法的精密度和準確度，具體結(jié)果見表3中1# 和2#所示。結(jié)果表明，兩種樣品中煙草果膠的平均回收率為97.3 %，相對標準偏差(RSD)為3.0 %～4.2 %，表明本方法準確性好、精密度高。實驗中以NMR光譜圖S/N=3和S/N=10時計算果膠樣品的檢出限和定量下限分別為0.42 mg/g和1.27 mg/g。

為驗證前處理及整個定量方法的準確性，實驗中還在煙草果膠提取過程中添加了已知果膠含量（8.46 %）標準煙草樣品2 g和6 g，與煙草樣品合在一起共10 g進行隨后的酸解和純化過程，最后進行13C CP/MAS NMR光譜分析果膠樣品的聚半乳糖醛酸，每個樣測定三次，計算整個過程的平均回收率和相對標準偏差如表3中3# 和4# 所示，結(jié)果顯示兩種樣品中煙草果膠的平均回收率為92.5%，相對標準偏差(RSD)為4.4 %—4.9 %，表明整個定量方法準確性好，精密度滿足分析要求。

表3 煙草果膠樣品添加PGalA標樣和標準煙樣的回收率和重復(fù)性結(jié)果Tab. 3 Recovery and repetition data for pectin added with PGalA and standard tobacco samples

2.4 煙草果膠分子結(jié)構(gòu)的測定

2.4.1 果膠分子中果膠酸和果膠酯酸的組成及比例

煙草果膠CP/MAS13C NMR光譜中，對應(yīng)于果膠的三種組成形式，δ169-178 ppm處對應(yīng)的果膠C-6信號峰可分解為三種不同位移的譜線[10]，如圖3所示：(a) 果膠酸：COOH, —171 ppm；(b）果膠酸甲酯：COOCH3，—174 ppm；(c）果膠酸鹽：COO-，—176 ppm。根據(jù)提取時酸度的不同，果膠酸鹽和果膠酸不同時存在，但與果膠酸酯同時存在。對C6信號峰（δ169-178 ppm）擬合，利用混合洛侖茲和高斯函數(shù)模型并借助DWIN-NMR軟件完成擬合過程，實現(xiàn)δ169-178 ppm處對應(yīng)的果膠C-6信號峰的分析和分解（如圖3），可得出果膠分子中果膠酸和果膠酯酸的組成及比例。

圖3 果膠分子中13C CP/MAS NMR C-6信號峰的光譜擬合Fig. 3 Spectral fi tting of 13C CP/MAS NMR C-6 in pectin molecules

2.4.2 果膠分子中甲酯度的計算

果膠結(jié)構(gòu)可以分為以下三種類型：同型半乳糖醛酸聚糖(HG)，鼠李半乳糖醛酸聚糖I (RGI)和鼠李半乳糖醛酸聚糖II (RGII)[17]。HG型果膠分子的甲酯度和乙酰度對果膠的性能有直接的影響[18]，尤其是果膠的水溶性和凝膠性能，植物果膠的甲酯度在植物生長過程中還影響果膠酶的調(diào)節(jié)作用。另外，果膠的主鏈上存在酯基和?；裙δ芑鶊F也有利于果膠的改性。如煙草提取的果膠樣品圖4所示，在其光譜峰C-6區(qū)（δ166-180ppm）有聚半乳糖醛酸和其甲酯(-COOH和-COOCH3) 同時存在，另外在δ53 ppm也有很強的-COOCH3吸收，這說明煙草果膠樣品的甲酯度較高。根據(jù)δ169- 178 ppm處對應(yīng)的果膠C-6信號峰及其分解擬合COOCH3，—174 ppm譜線面積，結(jié)合果膠分子中COOCH3（δ50-55 ppm）C信號峰面積，計算出煙草果膠樣品中甲酯度。

或

圖4 含有甲酯基團的煙草果膠樣品13C CP/MAS NMR光譜圖Fig. 4 13C CP/MAS NMR spectra of pectin in tobacco samples containing methylester group

表4 不同方法測定的煙草果膠樣品的甲酯化度結(jié)果Tab. 4 DM data of pectin in tobacco samples by different methods

此外，實驗中還采用紅外光譜法測定部分樣品的甲酯度[19]，結(jié)果如表4所示。由表可見，采用C-6信號峰光譜分解擬合計算的樣品甲酯度與采用紅外光譜法測定的酯化度相當接近，大多數(shù)采用果膠分子中COOCH3（δ50-55 ppm）C信號峰面積計算出甲酯度也相一致，個別樣品略有出入，這可能是由于13C CP/MAS NMR光譜中由于各個C所處的環(huán)境不同，交叉極化的弛豫時間也不一樣，采用不同C之間峰面積進行比較，存在一定誤差[20]。值得一提的是，由于紅外光譜測定的是果膠分子的總酯化度，包括甲酯度和乙酯度，由于煙草果膠中乙酯非常低，因此總酯化度與甲酯度基本一致。

2.4.3 果膠分子中乙酰度的計算

如煙草提取的果膠樣品圖5所示，在其光譜峰C-6區(qū)（δ166-180 ppm）有聚半乳糖醛酸和其酯基同時存在，在δ53 ppm也有很強的-COOCH3吸收，但δ21 ppm處的O-COCH3吸收較弱，這說明了煙草果膠樣品的乙酰度較低[21]。根據(jù)δ169-178 ppm處對應(yīng)的果膠C6信號峰，結(jié)合果膠分子中O-COCH3（δ20-25 ppm）中C信號峰面積，可計算出煙草果膠樣品中乙酰度。

需要說明的是，對于高乙酰度的果膠樣品，結(jié)果會更準確，低乙酰度誤差較大。實驗中測定了部分果膠樣品的乙酰度，如表4示，均較低。

圖5 含有甲酯和乙酰基團的煙草果膠樣品13C CP/MAS NMR光譜圖Fig. 5 13C CP/MAS NMR spectra of pectin in tobacco samples containing methylester and acetyl groups

2.5 不同來源煙草果膠大分子分析

分別用本方法與經(jīng)典的重量法及現(xiàn)行行業(yè)標準方法（水解后進行離子色譜分析）對4種國產(chǎn)不同類型的煙草樣品進行了提取和分析，平行測定三次，結(jié)果如表5所示。從果膠的含量來看，三種方法測得的結(jié)果相差不大，四種不同類型的煙葉果膠的含量范圍為7.0-9.8 %之間，重量法結(jié)果比NMR光譜法和離子色譜法略高些，可能是少量蛋白質(zhì)、草酸等雜質(zhì)引起的[22]，另外重量法的平均變異系數(shù)RSD ＞ 5%，但NMR光譜法和離子色譜法均低于5 %，說明采用NMR光譜法測定煙草樣品中果膠的含量也是可靠的。同時采用13C CP/MAS NMR光譜法不僅可以得到煙草樣品中果膠的含量，更為重要的是可以得到果膠的甲酯化度，四種樣品中廣州曬煙煙葉果膠的甲酯化度最高(53.2 %)，湖北白肋煙煙葉果膠的甲酯化度最低(36.6 %)，可見不同類型的煙葉果膠的甲酯化度還是有明顯差別的。Lauterbach等曾采用熱解氣相色譜-質(zhì)譜法測定了各種商業(yè)等級調(diào)制后的烤煙、白肋煙和香料煙中可溶性果膠的甲基化和酰胺化程度。結(jié)果表明，烤煙的可溶性果膠的甲基化和酰胺化程度較高。白肋煙的甲基化程度最低，與本文的結(jié)果相一致。另外，雖然采用相同的提取工藝，但是對于不同類型的煙葉樣品，果膠的得率相差較大，對提取的果膠純度也有影響，不過并不影響最終果膠含量的分析。

表5 13C CP/MAS NMR光譜法與離子色譜法及重量法分析不同煙草果膠樣品結(jié)果比較Tab. 5 Analysis of pectin in different tobacco samples by NMR spectra method, ion chromagraphic and gravimetric method (n = 3 )

3 結(jié)論

本文針對煙草果膠進行了優(yōu)化酸提取，再對其CP / MAS13C NMR光譜圖C-6吸收峰光譜分析煙草果膠的含量和結(jié)構(gòu)，并與經(jīng)典方法進行了比較。結(jié)果表明，CP / MAS13C NMR光譜法可以同步實現(xiàn)煙草中果膠的含量和結(jié)構(gòu)分析，C-6吸收峰的化學(xué)位移和峰面積可用于計算果膠中果膠分子中聚半乳糖醛酸的含量及組成、甲酯度和乙酰度的含量等，并應(yīng)用于實際煙草樣品的分析。

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Quantitative and structure analysis of pectin in tobacco by13C CP / MAS NMR spectroscopy

LIU Baizhan1, ZHENG Saijing1, GAO Yun2, ZHU Xiaolan2
1 Key Laboratory of Cigarette Smoke Research , China National Tobacco Corporation, Shanghai 200082, China；
2 Research Center of Tobacco and Health, University of Science and Technology of China, Hefei 230052, China

A method utilizing13C CP / MAS NMR spectra was developed for quantitative determination and structure analysis of pectin in tobacco. NMR spectra was employed to measure pectin after the extraction of tobacco samples with acid under optimized condition and was applied to calculate galacturonic acid content (GalA), degree of methylation (DM) and acetylation (DA) by peak fi tting in C-6 region. Results were in good agreement with convenient methods (chromography and gravimetric method) and NMR method could realize quantitative and structure analysis of pectin in tobacco simultaneously.

tobacco; pectin; NMR spectroscopy; structure analysis

:LIU Baizhan, ZHENG Saijing, GAO Yun, et al. Quantitative and structure analysis of pectin in tobacco by13C CP / MAS NMR spectroscopy [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21 (2)

劉百戰(zhàn)，鄭賽晶，高蕓,等.13C CP/MAS NMR光譜法分析煙草果膠的含量和結(jié)構(gòu)[J]. 中國煙草學(xué)報，2015,21（2）

國家煙草專賣局煙草行業(yè)卷煙煙氣重點實驗室開放基金項目(SZBCW201300708)

劉百戰(zhàn)(1965—)，博士，高級研究員，主要從事煙草化學(xué)與分析研究。

朱曉蘭(1972—),博士， E-mail: zxl8906@ustc.edu.cn。

2014-04-03