李 敏，李新強(qiáng)，付琳琳，吳 余，王 虹，唐小燕，付素珍#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科 衛(wèi)輝453100 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 新鄉(xiāng)453003

腎臟纖維化是所有慢性腎臟疾病發(fā)展至腎功能衰竭的共同通路，其中腎小管-腎間質(zhì)纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積為主要病理特征［1］。腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)與腎小管-腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在腎小管上皮細(xì)胞EMT 過程中發(fā)揮重要作用，是目前公認(rèn)的有效的促纖維化因子［2］。因此，抑制TGF-β1 的表達(dá)對于防治腎小管-腎間質(zhì)纖維化具有重要意義。作者擬覆蓋TGF-β1 基因cDNA 全長，設(shè)計和篩選靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，以期為進(jìn)一步研究參與TGF-β1 誘導(dǎo)腎小管-腎間質(zhì)纖維化的下游分子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 人腎小管上皮細(xì)胞株HKC 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫，p-Genesil-1 空載質(zhì)粒和E．coli DH 5α 大腸桿菌為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室保存，BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、SalⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶均為大連TaKaRa 公司產(chǎn)品，D-葡萄糖為美國Aladdin 公司產(chǎn)品，兔抗TGF-β1 多克隆抗體為美國Abcam 公司產(chǎn)品，鼠抗人β-actin 單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔和辣根酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗為美國Santa Cruz 公司產(chǎn)品，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1．2 靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的shRNA 的設(shè)計和制備 按照siRNA 設(shè)計原則，覆蓋TGF-β1 基因cDNA全長，設(shè)計靶向沉默TGF-β1 的shRNA 5 條(表1)，并進(jìn)行同源性分析。shRNA 的DNA 序列送大連TaKaRa 公司合成并退火。

1．3 靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的shRNA 真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建含沉默TGF-β1 shRNA的p-Genesil-shRNA 真核表達(dá)重組質(zhì)粒及含無關(guān)shRNA 的p-Genesil-1-shRNA-vect 重組質(zhì)粒。將目的片段shRNA 和質(zhì)粒載體p-Genesil-1 在T4 DNA連接酶作用下16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h 后挑取單克隆，37℃搖床過夜振搖擴(kuò)增，取1 mL 菌液送大連TaKaRa 公司測序鑒定;菌液中提取質(zhì)粒行SalⅠ酶切鑒定，質(zhì)粒p-Genesil-1 的多克隆位點(diǎn)如下:-XbaⅠ-SalⅠ-EcoRⅠ-U6 Promotor-BamHⅠ-shRNA-HindⅢ-;在插入的shRNA 的3'端設(shè)計了一個SalⅠ的酶切位點(diǎn)GTCGAC(表1)，若插入正確，SalⅠ單酶切時可切出一條約400 bp 的DNA 條帶。

1．4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 以腎小管上皮細(xì)胞HKC 為研究對象，常規(guī)培養(yǎng)高糖(0．5 mol/L)或Ang Ⅱ(10－3mol/L)刺激的HKC 至對數(shù)生長期時，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染8 h 后，去除含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，換成新鮮的細(xì)胞生長培養(yǎng)基，48 h 后用G418 進(jìn)行篩選，篩選后擴(kuò)增細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)入p-Genesil-shRNA 1～5重組質(zhì)粒及p-Genesil-1-shRNA-vect 質(zhì)粒的細(xì)胞分別命名為p-Genesil-shRNA1～5 細(xì)胞和p-Genesil-1-vect 細(xì)胞。

1．5 高糖刺激后各組細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)的Western blot 檢測 收集HKC 細(xì)胞及高糖或AngⅡ刺激的HKC 細(xì)胞、p-Genesil-1-vect 細(xì)胞和各組p-Genesil-shRNA 細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并按Bradford方法進(jìn)行定量，變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳和轉(zhuǎn)膜，50 g/L 脫脂牛奶封閉，室溫2 h，一抗室溫?fù)u育2 h，二抗室溫?fù)u育2 h，按照增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒操作步驟進(jìn)行顯色、曝光，最后顯影、定影、掃描。以β-actin 為內(nèi)參照，蛋白上樣量均為150 μg，鼠抗人β-actin 單克隆抗體、兔抗TGF-β1 多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔和辣根酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗的稀釋度分別為1 ∶1 000、1 ∶300、1 ∶5 000 和1∶5 000。通過Quantity one 軟件分析Western blot目的條帶與內(nèi)參照條帶的灰度比值。每組均設(shè)5個平行對照組。

表1 靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的shRNA 序列

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16．0 進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t 檢驗比較高糖刺激或Ang Ⅱ刺激后各組細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的shRNA 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定 見圖1。構(gòu)建的p-Genesil-shRNA1、2、3、4 和5 真核表達(dá)重組質(zhì)粒通過SalⅠ酶切鑒定結(jié)果顯示5個shRNA 重組質(zhì)粒均可切出與預(yù)計相符的400 bp 的片段。測序結(jié)果也顯示所有重組質(zhì)粒中，目的片段插入位點(diǎn)和方向正確，無堿基突變、插入、丟失，與實驗設(shè)計相一致。

圖1 靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的shRNA 真核表達(dá)重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2．2 靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的shRNA 的篩選 見圖2、3 和表2、3。Western blot 結(jié)果顯示:與HKC 細(xì)胞相比，高糖或Ang Ⅱ刺激的HKC 細(xì)胞和p-Genesil-1-vect 細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)均增高，高糖或AngⅡ刺激的HKC 細(xì)胞和p-Genesil-1-vect 細(xì)胞中TGFβ1 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖或Ang Ⅱ刺激的p-Genesil-1-vect 細(xì)胞相比，高糖或Ang Ⅱ刺激的各組p-Genesil-shRNA 細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)均降低。

圖2 高糖刺激時各組細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)的Western blot 檢測

圖3 Ang Ⅱ刺激時各組細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)的Western blot 檢測

表2 高糖刺激時各組細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)的Western blot 檢測結(jié)果(n=5)

表3 Ang Ⅱ刺激時各組細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)的Western blot 檢測結(jié)果(n=5)

3 討論

EMT 在腎小管-腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用，其發(fā)生發(fā)展受TGF-β/Smad 多條信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控;TGF-β1 是最為關(guān)鍵的促纖維化生長因子，有研究［3］報道TGF-β1 在腎臟纖維化進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用。TGF-β1 主要在腎臟中表達(dá)，由腎小管上皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌，它不僅可以誘導(dǎo)多種ECM 成分的表達(dá)，而且可以通過減少蛋白酶及其激活物的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶，增加蛋白酶抑制劑以及金屬蛋白酶組織抑制劑來抑制ECM 的降解。另外，TGF-β1 還是強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)因子，對巨噬細(xì)胞等有強(qiáng)大的趨化作用。因此，TGF-β1 不僅對腎臟纖維化形成過程有重要作用，而且對慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展也可能產(chǎn)生潛在性的影響。因此，沉默TGF-β1 的表達(dá)有可能阻斷、逆轉(zhuǎn)或至少延緩腎臟纖維化的發(fā)生［4-7］，有利于對腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制和治療策略進(jìn)行深入的研究。因此，為了研究參與TGF-β1 誘導(dǎo)腎小管-腎間質(zhì)纖維化的下游分子，該研究對靶向沉默TGF-β1 表達(dá)的方法進(jìn)行了探索。

隨著RNA 干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)在基因功能、腫瘤等研究中的廣泛應(yīng)用［8-9］，以DNA為模板胞內(nèi)合成shRNA 表達(dá)載體的RNAi 技術(shù)為研究提供了更為簡便和實用的方法。shRNA 表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中后，經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)酶切機(jī)制形成siRNA，從而使靶基因沉默數(shù)周甚至數(shù)月。到目前為止，僅有學(xué)者［10］通過siRNA 沉默TGF-β1，觀察了其對大鼠系膜細(xì)胞纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的影響，未見以腎小管上皮細(xì)胞為研究對象的siRNA 沉默TGFβ1 的相關(guān)報道。因此，該研究覆蓋TGF-β1 基因cDNA 全長，設(shè)計和制備了靶向沉默TGF-β1 的5 條shRNA，并構(gòu)建和鑒定了含TGF-β1 shRNA 的p-Genesil-shRNA 真核表達(dá)重組質(zhì)粒。

該研究進(jìn)結(jié)果顯示，與HKC 細(xì)胞相比，高糖或AngⅡ刺激的HKC 細(xì)胞和p-Genesil-1-vect 細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)均增高，而后二者之間TGF-β1 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與高糖或AngⅡ刺激的p-Genesil-1-vect 細(xì)胞相比，高糖或AngⅡ刺激的各組p-Genesil-shRNA 細(xì)胞中TGF-β1 表達(dá)均降低。

綜上所述，作者篩選出1 條可靶向沉默TGF-β1表達(dá)的shRNA，為進(jìn)一步研究參與TGF-β1 誘導(dǎo)腎小管-腎間質(zhì)纖維化的下游分子奠定了基礎(chǔ)。

［1］Zeisberg M，Neilson EG．Mechanisms of tubulointerstitial fibrosis［J］．J Am Soc Nephrol，2010，21(11):1819

［2］López-Hernández FJ，López-Novoa JM．Role of TGF-β in chronic kidney disease:an integration of tubular，glomerular and vascular effects［J］．Cell Tissue Res，2012，347(1):141

［3］Lee HS．Mechanisms and consequences of TGF-β overexpression by podocytes in progressive podocyte disease［J］．Cell Tissue Res，2012，347(1):129

［4］Kasuga H，Ito Y，Sakamoto S，et al．Effects of anti-TGF-beta type Ⅱreceptor antibody on experimental glomerulonephritis［J］．Kidney Int，2001，60(5):1745

［5］Fukasawa H，Yamamoto T，Suzuki H，et al．Treatment with anti-TGF-beta antibody ameliorates chronic progressive ne-phritis by inhibiting Smad/TGF-beta signaling［J］．Kidney Int，2004，65(1):63

［6］Petersen M，Thorikay M，Deckers M，et al．Oral administration of GW788388，an inhibitor of TGF-beta type ⅠandⅡreceptor kinases，decreases renal fibrosis［J］．Kidney Int，2008，73(6):705

［7］Wang B，Koh P，Winbanks C，et al．miR-200a prevents renal fibrogenesis through repression of TGF-β2 expression［J］．Diabetes，2011，60(1):280

［8］Ozpolat B，Sood AK，Lopez-Berestein G．Liposomal siRNA nanocarriers for cancer therapy［J］．Adv Drug Deliv Rev，2014，66:110

［9］Davies JA，Unbekandt M．siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture［J］．Methods Mol Biol，2012，886:295

［10］毛華雄．siRNA 沉默TGF-β1 對大鼠腎系膜細(xì)胞纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的影響［D］．長沙:中南大學(xué)，2006．