吳 余，崔 靜，王 虹，付琳琳，李 航，田明振，馮思佳，楊 璐，趙二趁，千新來(lái)，原志慶

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室新鄉(xiāng)453003

高危型人乳頭瘤病毒(high risk-human papillomaviruses，HR-HPVs)(如HPV16 等)病毒癌基因E6的持續(xù)表達(dá)是宮頸癌最重要的致病因素［1］。該課題組設(shè)計(jì)并篩選了靶向HPV16 E6 且沉默效應(yīng)均達(dá)95%以上的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，經(jīng)Agilent 人基因組表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)沉默E6 表達(dá)后粘蛋白抗原16(mucin antigen 16，MUC16)基因表達(dá)下調(diào)。MUC16 是否是HPV16 E6的直接作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究E6 與MUC16 的關(guān)系，對(duì)探索HPV16 相關(guān)腫瘤新的治療方法具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)以HPV16 E6陽(yáng)性和陰性的宮頸癌細(xì)胞系和宮頸鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱鱗癌)組織為研究對(duì)象，采用Western blot 和免疫組化方法，從細(xì)胞和組織水平分析HPV16 E6 和MUC16 表達(dá)的關(guān)系，以豐富HPV16 E6 的致癌機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞 HPV16 陽(yáng)性的宮頸癌CaSki 細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞以及HPV16 陰性的宮頸癌C-33A 細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)條件均為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L)的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1．1．2 組織標(biāo)本來(lái)源 從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院和新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院收集宮頸鱗癌組織184例。每例標(biāo)本常規(guī)制備石蠟切片(厚約3 μm)。

1．1．3 主要試劑 胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;DMEM 培養(yǎng)基為美國(guó)Millipore 公司產(chǎn)品;二硫蘇糖醇(DTT)、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)為德國(guó)Merk 公司產(chǎn)品;鼠抗人βactin 單克隆抗體、山羊抗HPV16 E6 多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗、辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒均為美國(guó)Santa Cruz 公司產(chǎn)品;兔抗人MUC16多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;DAB 試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;免疫組化試劑盒為美國(guó)Zymed 公司產(chǎn)品。

1．2 Western blot 方法檢測(cè)HPV16 E6 及MUC16的表達(dá) 常規(guī)培養(yǎng)、消化并收集細(xì)胞，提取總蛋白。取10 μL 按Bradford 方法進(jìn)行蛋白定量，對(duì)其余蛋白進(jìn)行變性處理，將1/5 蛋白體積的DTT 和4/5 蛋白體積的2 ×SDS 上樣緩沖液與蛋白樣品混勻后放入沸水中煮5 min，－80℃保存?zhèn)溆?。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western blot 檢測(cè)E6 和MUC16 的表達(dá)。以β-actin 為內(nèi)參，蛋白上樣量均為150 μg，鼠抗人β-actin 單克隆抗體、山羊抗HPV16 E6 多克隆抗體、兔抗人MUC16 多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗、辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗和辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋度分別為1∶1 000、1 ∶300、1 ∶500、1 ∶5 000、1 ∶5 000 和1∶5 000。采用Bandscan 5．0 軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．3 免疫組化方法檢測(cè)HPV16 E6 及MUC16 的表達(dá) 采用PV-9000 法。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，在枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液(pH =6．0)中進(jìn)行微波修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液室溫孵育20 min、正常山羊血清室溫孵育20 min 后，加稀釋好的一抗工作液(HPV16 E6 為1∶50，MUC16為1∶100)，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。加通用型IgG 抗體-辣根過(guò)氧化物酶多聚體，室溫孵育30 min。顯色，復(fù)染，經(jīng)梯度乙醇、二甲苯處理后，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。E6 為細(xì)胞核染色，MUC16 為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色。400 倍鏡下選取5個(gè)視野(每個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞不少于200個(gè))，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定［2］。①按細(xì)胞著色深淺評(píng)分:無(wú)色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別評(píng)為0、1、2、3 分。②按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞、陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜30%、30%～70%、＞70%分別評(píng)為0、1、2、3 分。取2 項(xiàng)評(píng)分之和作為總分，0～1 分為陰性，≥2 分為陽(yáng)性。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16．0 進(jìn)行分析。不同組間MUC16 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。HPV16 E6 陽(yáng)性和陰性鱗癌組織中MUC16 陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 Western blot 方法檢測(cè)HPV16 陽(yáng)性和陰性宮頸癌細(xì)胞中E6 的表達(dá) Western blot 結(jié)果(圖1)顯示:C-33A 細(xì)胞中HPV16 E6 無(wú)表達(dá)，CaSki 細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞中可見(jiàn)HPV16 E6 表達(dá)。

圖1 Western blot 方法檢測(cè)HPV16 陽(yáng)性和陰性宮頸癌細(xì)胞中E6 的表達(dá)

2．2 Western blot 方法檢測(cè)HPV16 陽(yáng)性和陰性宮頸癌細(xì)胞中MUC16 的表達(dá) Western blot 結(jié)果(圖2、表1)顯示:C-33A 細(xì)胞中MUC16 的表達(dá)低于Si-Ha 細(xì)胞和CaSki 細(xì)胞，CaSki 細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞中MUC16 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．3 宮頸鱗癌組織分組 免疫組化染色結(jié)果(圖3)顯示:184例宮頸鱗癌組織中，HPV16 E6 陽(yáng)性宮頸鱗癌組織138例，HPV16 E6 陰性宮頸鱗癌組織46例。

圖2 Western blot 方法檢測(cè)HPV16 陽(yáng)性和陰性宮頸癌細(xì)胞中MUC16 的表達(dá)

表1 Western blot 方法檢測(cè)HPV16 陽(yáng)性和陰性宮頸癌細(xì)胞中MUC16 的表達(dá)(n=3)

圖3 HPV16 E6 陽(yáng)性(A)和陰性(B)宮頸鱗癌組織染色結(jié)果(PV-9000，×200)

2．4 HPV16 E6 陽(yáng)性和陰性宮頸鱗癌組織中MUC16 的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果(表2、圖4)顯示:MUC16 陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒;HPV16 E6 陽(yáng)性宮頸鱗癌組織中MUC16 的表達(dá)高于HPV16 E6 陰性宮頸鱗癌組織。

表2 MUC16 在HPV16 E6陽(yáng)性和陰性宮頸鱗癌組織中的表達(dá)

圖4 宮頸鱗癌組織中MUC16 陽(yáng)性(A)和陰性(B)表達(dá)(PV-9000，×200)

3 討論

HPVs 感染宿主后，其早期基因E6 整合入宿主細(xì)胞基因組DNA 中并恒定表達(dá)。E6 蛋白能與宿主細(xì)胞內(nèi)的E6 相關(guān)蛋白(E6 associated protein，E6AP)形成E6-E6AP 復(fù)合物，該復(fù)合物可與P53 結(jié)合形成E6-E6AP-P53 復(fù)合物，通過(guò)泛素依賴途徑使P53 降解失活，易導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［3-4］。該課題組設(shè)計(jì)并篩選了靶向HPV16 E6 且沉默效應(yīng)均達(dá)95%以上的shRNA，經(jīng)Agilent 人基因組表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)沉默E6 表達(dá)后MUC16 基因表達(dá)下調(diào)。因此，深入研究E6 與MUC16 的關(guān)系，對(duì)豐富HPV16 E6的致癌機(jī)制，探索HPV16 相關(guān)腫瘤新的治療方法具有重要意義。

MUC16 又稱CA125，是卵巢癌的重要標(biāo)志物。MUC16 在宮頸癌、胰腺癌、卵巢癌組織中均表達(dá)增高［5-7］。研究顯示:①M(fèi)UC16 激活Janus 蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路，磷酸化的STAT3 能反式激活c-Jun，誘導(dǎo)cyclinD1 表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖［8］。②MUC16 通過(guò)與腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體相互作用，抑制細(xì)胞凋亡［9］。③MUC16 高表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)［10］。

該研究中，Western blot 結(jié)果顯示，C-33A 細(xì)胞中MUC16 的表達(dá)低于SiHa 細(xì)胞和CaSki 細(xì)胞，CaSki 細(xì)胞和SiHa 細(xì)胞中MUC16 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示，HPV16 E6 陽(yáng)性宮頸鱗癌組織中MUC16 的表達(dá)高于HPV16 E6 陰性宮頸鱗癌組織。說(shuō)明MUC16 與HPV16 E6 的表達(dá)有關(guān)，MUC16 在HPV16 相關(guān)宮頸癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果也提示在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，E6 和MUC16 之間可能存在直接或間接的調(diào)控關(guān)系，其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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