(天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 天津 300070)

齲病是細(xì)菌性疾病,可以繼發(fā)牙髓炎和根尖周炎,甚至能引起牙槽骨和頜骨炎癥。齲病特點(diǎn)是發(fā)病率高,分布廣。是口腔主要的常見病,也是人類最普遍的疾病之一,世界衛(wèi)生組織已將其與腫瘤和心血管疾病并列為人類三大重點(diǎn)防治疾病。

牙菌斑則為齲病發(fā)生的始動(dòng)因子,其為基質(zhì)包裹的互相粘附、或粘附于牙面、牙間或修復(fù)體表面的軟而未礦化的細(xì)菌性群體,為不能被水沖去或漱掉的一種細(xì)菌性生物膜。牙菌斑生物膜能夠容納多種多樣的菌屬生存其中,其成層的結(jié)構(gòu)中包含了對(duì)氧敏感性不同的需氧菌、兼性厭氧菌和絕對(duì)厭氧菌。而其中尤以變異鏈球菌為致齲優(yōu)勢(shì)菌,故本課題從中藥體外抑制變異鏈球菌入手,以期可有效地降低齲病等口腔疾病的發(fā)生率。

近年來,隨著各相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展,對(duì)中藥及其有效成分具體作用機(jī)理的研究有了長(zhǎng)足進(jìn)展。在一定程度上揭示了抗炎特點(diǎn)及對(duì)各系統(tǒng)的影響。與現(xiàn)代藥理學(xué)相對(duì)應(yīng),中藥抗炎的機(jī)理研究一般從對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)釉的影響、干擾花生四烯酸代謝及抗組胺效應(yīng)、免疫抑制等幾方面進(jìn)行。此外還有從抑制白細(xì)胞活化、抗血小板等方面的闡釋。甘草等中藥的抗炎機(jī)理與臨床應(yīng)用是當(dāng)今世界新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

變異鏈球菌培養(yǎng)基、高壓蒸汽滅菌鍋、米基爐、一次性培養(yǎng)皿、牙菌斑染色劑、口腔探針、牙菌斑染色劑、布氏漏斗、藥敏片、青霉素瓶、中藥液瓶、玻璃棒、鑷子、濾紙、牛皮紙、打孔器、游標(biāo)卡尺。

表1 變異鏈球菌生化鑒定表

表2 多種中藥對(duì)變異鏈球菌抑制作用數(shù)據(jù)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)菌

稱取粉末狀培養(yǎng)基,取蒸餾水。輕輕搖勻,直至水中無肉眼可見顆粒。加熱煮沸,使其完全溶解。121.3℃高溫滅菌15分鐘。將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右,以無菌操作傾注于一次性培養(yǎng)皿(直徑70mm的平皿),待培養(yǎng)基凝固后將器皿翻轉(zhuǎn),至4℃保存使用。

選擇全身健康狀況良好,全口不得少于20顆功能牙,試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素和使用漱口液,受試牙發(fā)育正常的志愿者。要求志愿者48h不刷牙。咀嚼牙菌斑染色劑三分鐘,清水漱口,探針刮取牙菌斑,溶于生理鹽水中。

用接種環(huán)蘸取有菌的生理鹽水,用連續(xù)劃線分離法將菌斑接種到變異鏈球菌選擇培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)基置于CO2恒溫箱(CO25%,溫度37℃),培養(yǎng)24小時(shí)作為第一代。繼而純化;使用液體培養(yǎng)基富集;后進(jìn)行傳代,依次培養(yǎng)。

1.2.2 中藥有效成分制備

查閱《本草綱目》、《中國(guó)藥典》等中草藥書籍,挑選出大青葉、竹葉、柴胡、丹皮、麥冬、土茯苓、板藍(lán)根、苦參、射干、紫草、穿心蓮、龍葵、魚腥草、秦皮、狗脊、山慈菇、玄參十七種中藥。所選中藥均具有抗炎殺菌,清熱解毒且禁忌癥較少特性,適宜人群較為廣泛。將中藥碾磨成粉。以甘草為例:取甘草粉末20.0克,加入110毫升75%乙醇,加入少許沸石,磁力攪拌電熱套加熱回流2小時(shí),溫度(80℃—85℃)。2小時(shí)后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾,得深棕色濾液,濾液進(jìn)行減壓冷凝,溫度同上,直至無醇味,餾出液滴出緩慢為止。濾渣再次進(jìn)行加熱回流半小時(shí),抽濾,棄去濾渣,濾液同樣進(jìn)行減壓冷凝。將兩次的藥液合并得粗品液,約18毫升。將粗品液均分為兩份,各9毫升,一份直接用于制備藥敏片,另一份進(jìn)行萃取。

圖1 臨床分離株革蘭染色,箭頭所指為變異鏈球菌 X1000

圖2 甘草抑菌圈效果

將粗品液倒入分液漏斗,加入25毫升氯仿,充分振搖,放氣,重復(fù)三次,靜置放液。棄上層液,放出下層液,做減壓冷凝,蒸出氯仿,溫度控制在60攝氏度左右。得到的萃取藥液。

1.2.3 制作藥敏片

用打孔器制作藥敏片,每個(gè)青霉素瓶?jī)?nèi)放20片。在鼓風(fēng)干燥箱里35℃干燥24h直至烘干。每味藥(萃取及粗體品)各取一支消毒的注射器,抽取適量中藥液(以完全浸透藥片為準(zhǔn)),注入青霉素瓶中,搖勻使藥液充分浸透半小時(shí),將瓶口用已消毒的牛皮紙封口包扎,在35～40℃恒溫箱內(nèi)過夜烘干。置于4-6℃冰箱里冷藏備用。

以藥敏試驗(yàn)法利用藥敏片半徑擴(kuò)散法檢測(cè)其是否有抗菌作用,比較同一中藥不同純度藥液(萃取與粗體)對(duì)變異鏈球菌活性的影響,確定適宜提取方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落檢測(cè)及細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌落肉眼觀察結(jié)果:細(xì)菌初代培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基上的菌落為較小的粉色菌落,邊界清楚。細(xì)菌次代純化培養(yǎng)后,經(jīng)革蘭染色,鏡下觀察可見,菌落為革蘭陽性小球菌,多呈短鏈狀,成對(duì)或分散排列。(如圖一)。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

對(duì)形態(tài)學(xué)觀察具有變異鏈球菌典型形態(tài)的臨床分離株,進(jìn)行傳統(tǒng)的生化鑒定.甘露醇、山梨醇、棉子糖和密二糖的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性者為黃色,七葉苷水解實(shí)驗(yàn)陽性者為黑色,加3%過氧化氫后產(chǎn)生大量氣泡者為觸媒實(shí)驗(yàn)陽性。主要特性見表一。

2.3 藥敏片對(duì)細(xì)菌的抑菌作用

二十種藥液對(duì)變異鏈球菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)后,結(jié)果表明甘草粗提液對(duì)變異鏈球菌抑制效果最好,大青葉、秦皮也均出現(xiàn)較為明顯抑菌圈。(見表二)其余中藥對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)生作用較微弱,抑菌圈小于7mm,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,故不在此贅述。

圖二為甘草藥敏片置于培養(yǎng)皿上24h后,在涂布有變異鏈球菌的培養(yǎng)皿上的抑菌效果。說明甘草藥液中含有的抗菌物質(zhì)對(duì)變異鏈球菌不僅有效,而且效果最優(yōu)。在抑菌時(shí)間上,甘草藥敏片24h即可表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。

圖中箭頭所指為甘草藥敏片抑菌圈

3 討論

甘草著于《中華草本》,其功效益氣補(bǔ)中;緩急止痛;潤(rùn)肺止咳;瀉火解毒;調(diào)和諸藥。主倦怠食少等。西醫(yī)藥理發(fā)現(xiàn),甘草劑有抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)的功能,因此在西醫(yī)臨床上主要作為緩和劑。緩解咳嗽,祛痰,治療咽痛喉炎;對(duì)慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥有良好功效;甘草制劑能促進(jìn)胃部粘液形成和分泌,延長(zhǎng)上皮細(xì)胞壽命,有抗炎活性,常用于慢性潰瘍和十二指腸潰瘍的治療;甘草的黃酮具有消炎、解痙和抗酸作用;甘草也是人丹的主要原料之一。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)甘草對(duì)變異鏈球菌有抑制作用,可深入研究探討其對(duì)口腔齲病的治療效果。

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