柴楓，王偉 （浙江蕭山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州311201）

方勇 （浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州310016）

魯廣，萬宇，張菡，林科佳，徐公林 （浙江蕭山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州311201）

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是重要的專職抗原遞呈細(xì)胞［1］，但是由于免疫逃逸及靶向性的問題，基于DC的腫瘤疫苗并未達(dá)到預(yù)期效果，因此迫切需要增強(qiáng)DC提呈抗原的能力從而提高效應(yīng)的靶向性。黑色素瘤相關(guān)抗原基因是1991年BOON實(shí)驗(yàn)室首先鑒定發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MAGEA3在腎癌細(xì)胞株陽性表達(dá)率為100%，因此其被認(rèn)為是腎癌免疫治療研究中的理想靶抗原［2］。在DC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）起著明顯的抑制作用，并且在維持自身耐受性和限制抗腫瘤免疫方面能起著非常關(guān)鍵性作用［3］。

本研究采用分子生物學(xué)RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）構(gòu)建沉默細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（SOCS1）的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人臍血來源的DC，再負(fù)載MAGE－A3抗原肽，增強(qiáng)DC對(duì)MAGE－A3抗原的遞呈能力，提高DC的靶向性，并觀察對(duì)腎癌細(xì)胞殺傷能力，為腎癌的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人腎癌細(xì)胞株購自中科院培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；10%胎牛血清購自杭州四季青生物材料研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco，GM－CSF、IL－4、TNF－α、IFN－γ購自美國Peprotech，Trizol購自美國Invitrogen；MAGE－A3多肽（購自上海和元生物），兔抗人SOCS1多克隆抗體購自英國Abcam，兔抗人β－actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自博士德生物，抗人CD83、CD86和HLA－DR抗體購自Santa Cruz生物技術(shù)公司，相關(guān)引物設(shè)計(jì)與合成委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，F(xiàn)ACsort流式細(xì)胞儀（BD，US）；GDS800分析系統(tǒng)軟件（UVP，US）。

1.2 DCs的體外培養(yǎng)

取足月妊娠分娩的健康產(chǎn)婦臍血50ml，采用密度梯度離心法分離收集人臍血單個(gè)核細(xì)胞（HUBMC），調(diào)整密度至5×106／ml，吸取2ml加于24孔板中，然后在37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，移去懸浮細(xì)胞，然后每孔加入 DCs培養(yǎng)基（含rhGM－CSF100ng／ml、rhIL－4 50ng／ml的RPMI－1640）2ml，隔天半量換液，誘導(dǎo)分化第10天采用慢病毒感染。

1.3 SOCS1－SiRNA載體構(gòu)建及病毒產(chǎn)生

依據(jù)GenBank，針對(duì)SOCS1序列設(shè)計(jì)的SiRNA寡核苷酸由上海和元生物有限公司提供并合成，共2 對(duì) SiRNA 序 列， 序 列 1sense 5′－GACUGAUUC－CUAUUAAAUA－3′，antisense 5′－UAUUUAAUAGGA－AUCAGUC－3′；序列 2sense 5′－GCAUU－AACUGGGA－UGCCGUTT－3′，antisense 5′－ACGGCAUCCCAGUUA－AUGCTG－3′，直接連入酶切后的RNA干擾載體上，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，克隆后進(jìn)行鑒定，測序比對(duì)后陽性的克隆即為目的基因RNAi慢病毒載體，然后對(duì)病毒進(jìn)行包裝、純化及濃縮，陰性對(duì)照病毒滴度為2×109TU／ml，SOCS－1SiRNA病毒滴度為8×108TU／ml。

1.4 慢病毒感染樹突狀細(xì)胞

將DC誘導(dǎo)分化10d后分為4組：1組為空白對(duì)照，未感染任何病毒，2組感染陰性對(duì)照病毒（NC），3組感染慢病毒SOCS－1SiRNA－1，4組感染慢病毒SOCS－1SiRNA－2?；静僮鞑襟E：感染前為細(xì)胞換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值50，每孔加入感染培養(yǎng)基和病毒共500μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Western－Blot檢測SOCS－1敲減率。

1.5 Western blot檢測SOCS1的表達(dá)

總蛋白抽提，每個(gè)樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2g／L，上樣后經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1h，一抗（1∶200）4℃孵育過夜，二抗（1∶1000）室溫孵育2h，ECL顯色，X光顯影定影，用GDS800分析系統(tǒng)對(duì)Western－Blotting條帶進(jìn)行定量分析。

1.6 MAGE－3處理DC

慢病毒感染5d，將DC細(xì)胞分為4組：A組未處理DC組；B組為沉默SOCS1組；C組為未處理DC＋MAGE－A3多肽培養(yǎng)組，培養(yǎng)24h，加入TNF－α（50U／ml），繼續(xù)培養(yǎng)2d；D組為沉默SOCS1＋MAGE－A3多肽培養(yǎng)組。

1.7 DC分子表型檢測

將上述各組細(xì)胞液中分別加入FITC－CD83、PE－CD86、PE－HLA－DR，放置4℃環(huán)境中避光30min，采用1%多聚甲醛固定細(xì)胞，最終細(xì)胞液為500μl，然后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)情況，各試驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照組。

1.8 DC誘導(dǎo)的CTL的殺傷效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)組中由DC誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）稱為效應(yīng)細(xì)胞，以腎癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的比值分別設(shè)計(jì)為10∶1、20∶1和50∶1，嚴(yán)格參照MTT細(xì)胞毒性檢測試劑盒操作，依據(jù)公式計(jì)算出殺傷率：殺傷率（%）＝ ［（靶細(xì)胞A值＋效應(yīng)細(xì)胞A值－效靶混合細(xì)胞A值）／靶細(xì)胞A值］×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western blot實(shí)驗(yàn)評(píng)估基因沉默效果

感染SOCS－1SiRNA慢病毒的DC，蛋白表達(dá)水平顯著低于感染陰性對(duì)照慢病毒的DC（NC）（P＜0.05），SOCS－SiRNA－1蛋白有效敲減率為52%，SOCS－SiRNA－2蛋白有效敲減率為74%（圖1）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍血DCs的表面標(biāo)志

DC成熟的主要標(biāo)志是CD83、CD86、HLA－DR等（見表1）。

2.3 T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性

各組DC對(duì)T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的影響，D組DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷能力明顯高于其他各組（P＜0.05），并且隨效靶比的增高殺傷能力逐漸增強(qiáng)，效靶比50∶1時(shí)殺傷作用最強(qiáng)（見表2）。

圖1 SOCS1蛋白表達(dá)

表1 SOCS1－SiRNA轉(zhuǎn)染DC表面分子的變化

表2 CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率

3 討論

在腫瘤的生物治療中，以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗已成為目前臨床試驗(yàn)研究的方向［4］，但由于DC自身的免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力，因此目前以DC為中心的大多數(shù)腫瘤疫苗治療效果欠佳［5］。干擾SOCS1表達(dá)可上調(diào)DC表面共刺激分子CD83、CD80、CD86的表達(dá)，增加促炎性細(xì)胞因子如：IL－l、IL－12、IFN－γ、IL－6和TNF－α的分泌量，進(jìn)一步激活CTL反應(yīng)。SOCS1－SiRNA修飾的DC能明顯提高免疫應(yīng)答［6］。

MAGEA3是MAGE A家族的一員，基因位于X染色體q28區(qū)，含有3個(gè)外顯子，蛋白質(zhì)為分子量48000的胞質(zhì)蛋白，由314個(gè)氨基酸組成，由于其在各種惡性腫瘤中都有不同程度表達(dá)，而在正常組織除睪丸和胎盤之外，和良性腫瘤中幾乎不表達(dá)1［6，7］，故MAGE抗原已成為特異性免疫治療選擇中的理想靶分子，目前，國內(nèi)外許多學(xué)者都對(duì)MAGE－A3基因在不同惡性腫瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了深入研究［8］。有學(xué)者采用RT－PCR技術(shù)對(duì)10個(gè)腎癌細(xì)胞系中MAGE－A3基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，其陽性率為100%。因此，從理論上來說，由MAGE－A3抗原致敏DCs產(chǎn)生的CTL細(xì)胞，能夠?qū)δI癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用［9］。

在此項(xiàng)研究當(dāng)中，我們采用臍血來源的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增為樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)體系，采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建沉默細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（SOCS1）的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人臍血來源的DC，使之提呈抗原的能力顯著提高，再負(fù)載MAGE－A3抗原肽，以提高激對(duì)腎癌細(xì)胞殺傷能力。在此過程中我們選用了更有下調(diào)SOCS1作用的siRNA序列2進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明D組中DC表面成熟分子標(biāo)志CD83、CD86和HLA－DR的表達(dá)明顯高于其它各組（P＜0.05），故由此推斷SOCS1在DC成熟的過程中發(fā)揮重要作用。在D組中對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷率顯著高于未致敏的DC誘導(dǎo)的CTL組，并隨著效靶比的增高而增強(qiáng)，從而為臨床上治療腎癌提供科學(xué)依據(jù)。

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