阮?lèi)?ài)東，包天力，劉忱瀟，周笑腆

(1.河海大學(xué)水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210098;2.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，南京 210098)

煙堿 (nicotine)俗名尼古丁，是煙草類(lèi)植物中最具生物活性的化學(xué)物質(zhì)，占其總量的95%，也是使用最為廣泛的生物堿［1］。煙堿易于透過(guò)包含血腦屏障在內(nèi)的大多數(shù)生物膜，進(jìn)入人體后可在肝臟中被轉(zhuǎn)化為多種代謝物［2～8］。煙堿在合成和發(fā)酵過(guò)程中，可被轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈致癌作用的亞硝胺(Nitrosamine)［9］。動(dòng)物和人體攝入后還會(huì)促使血壓升高、脈搏加快、細(xì)胞膜自由脂肪酸增多和兒茶酚胺在血液中上升等［10～13］?？傊?，煙堿進(jìn)入環(huán)境后可對(duì)人體和動(dòng)物產(chǎn)生多種多樣的毒害作用。

中國(guó)是煙草生產(chǎn)大國(guó)，與之相伴產(chǎn)生的煙草廢棄物每年約為1.0×106噸，其煙堿含量在0.50～7.87%(干重)［14］。另外，隨著啶蟲(chóng)咪 (Acetamiprid)、吡蟲(chóng)啉 (Imidacloprid)等以煙堿為有效成分的殺蟲(chóng)劑的推廣使用，到2007年，已占世界殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)份額的20%［15］。由于煙堿易溶于水，存在于煙草廢棄物和煙堿型農(nóng)藥中的煙堿通過(guò)淋溶作用進(jìn)入土壤和地下水，改變土壤性狀、肥效及微生物群落結(jié)構(gòu)，所造成的環(huán)境污染問(wèn)題不容忽視［16］。

土壤細(xì)菌功能酶的活性標(biāo)志著土壤的肥力狀況，及土壤中各類(lèi)生化反應(yīng)的強(qiáng)度。而且，土壤細(xì)菌功能酶的活性與各類(lèi)環(huán)境因素緊密相關(guān)，尤其在受到污染的情況下，土壤細(xì)菌功能酶的活性更可在一定程度上反映土壤微生物群體對(duì)環(huán)境污染物的響應(yīng)機(jī)制和對(duì)污染物的降解活性［17～19］。多數(shù)研究集中在煙堿污染對(duì)昆蟲(chóng)的毒理學(xué)效應(yīng)，然而其對(duì)土壤細(xì)菌功能酶活性的相關(guān)研究成果尚鮮為報(bào)道。

本文以未受過(guò)煙堿和煙堿型農(nóng)藥污染的浙江大學(xué)華家池校區(qū)實(shí)驗(yàn)田土壤為材料，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的方法，系統(tǒng)地探究了不同濃度的外源煙堿污染對(duì)土壤細(xì)菌功能酶活性的影響及其動(dòng)態(tài)變化分析，為全面評(píng)價(jià)煙堿污染后環(huán)境健康質(zhì)量和以土壤生物活性判斷煙堿污染程度的生物預(yù)警機(jī)制提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土樣取自浙江大學(xué)華家池校區(qū)實(shí)驗(yàn)田土壤，表層土 (深度0～20 cm)。采樣方式為多點(diǎn)采集，樣品采集后于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)避光、通風(fēng)處風(fēng)干，經(jīng)混勻、碾磨、過(guò)2 mm篩后備用。供試土壤的主要理化性質(zhì)如表1所示。

表1 供試土壤的主要理化性質(zhì)Tab.1 The main physical and chemical properties of the soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

試驗(yàn)在塑料桶 (頂口直徑179 mm，底面直徑134 mm，高161 mm)中進(jìn)行。每桶底部以1.0 kg的碎石 (直徑約10 mm)坡度填充，四層塑料紗布封墊，以?xún)筛ＡЧ?(直徑1.0 cm，長(zhǎng)20 cm)于斜坡高處穿過(guò)紗布并與桶底連通。然后每桶裝土1.5 kg，經(jīng)玻璃管加水500 mL，逐步浸潤(rùn)桶中土壤。預(yù)設(shè)溫度28℃下培養(yǎng)2周后，分別加入100 mL不同濃度的煙堿溶液，使桶中土壤所含煙堿濃度 分 別 為:0、 0.004、 0.008、 0.012、 0.016、0.020、0.030、0.040 μg/g 干土。充分混勻，分別在培養(yǎng)0、7、14、21、28、35和42 d時(shí)，采用五點(diǎn)法取樣供土壤細(xì)菌功能酶活性測(cè)定使用。以上8組各設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 土壤酶活性測(cè)定方法

試驗(yàn)過(guò)程中定期取土樣，測(cè)定其過(guò)氧化氫酶、蛋白酶、脲酶和磷酸酶。土壤過(guò)氧化氫酶測(cè)定采用滴定法;脲酶測(cè)定采用比色法;磷酸酶的測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法;蛋白酶測(cè)定采用比色法。具體參照土壤酶及其研究法［17］。每個(gè)土樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙堿污染對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響

煙堿污染對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，在煙堿污染第7 d，對(duì)照組和各處理組其土壤過(guò)氧化氫酶活性較初始時(shí)刻均呈現(xiàn)升高狀態(tài)，煙堿污染各處理組活性升高幅度均低于對(duì)照組土壤，這說(shuō)明煙堿在添加初期延緩了土壤過(guò)氧化氫酶活性的升高波動(dòng)趨勢(shì)，表現(xiàn)為一定的抑制作用。

圖1 煙堿對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.1 Effect of nicotine on the activity of catalase in the soil of vegetables fields

與對(duì)照組不同，各處理組 (除去煙堿污染濃度為0.004和 0.008 μg/g干土外)土壤過(guò)氧化氫酶活性的升高趨勢(shì)一直延續(xù)至煙堿污染后第14 d，而對(duì)照組土壤過(guò)氧化氫酶活性顯著性降低。第28 d和第35 d，各處理組土壤過(guò)氧化氫酶活性與對(duì)照組相比均表現(xiàn)為高于或顯著性高于 (p＜0.05)。由以上結(jié)果可見(jiàn)，煙堿污染對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性表現(xiàn)為起初抑制，而后轉(zhuǎn)為刺激提高。這一變化可能與煙堿污染對(duì)土壤微生物區(qū)系的更迭及其豐度的變化等有一定關(guān)系。

煙堿污染第42 d時(shí)，對(duì)照組和各處理組土壤過(guò)氧化氫酶活性再次表現(xiàn)為升高狀態(tài)，但其升高幅度的顯著性 (p＜0.05)或極顯著性 (p＜0.01)低于對(duì)照組土壤。

2.2 煙堿污染對(duì)土壤蛋白酶活性的影響

煙堿污染對(duì)土壤蛋白酶活性的影響如圖2所示。煙堿污染7 d后，土壤蛋白酶的活性在各處理組顯著低于或極顯著低于對(duì)照組，經(jīng)t-檢驗(yàn)，煙堿污染濃度為 0.012和0.016 μg/g干土處理的土壤蛋白酶活性顯著性低于對(duì)照組 (p＜0.05)，而煙堿污染濃度分別為 0.02、0.03 和 0.04 μg/g 干土處理的土壤蛋白酶活性與對(duì)照組相比存在極顯著性差異 (p＜0.01)。

而在第14 d，各處理組土壤酶活性均無(wú)顯著性差異，到第 21 d，除了 0.004 和 0.008 μg/g干土處理的土壤蛋白酶活性低于對(duì)照組，其余各處理組的土壤蛋白酶活性均得到激發(fā)，其中0.012和0.016 μg/g干土處理組的土壤蛋白酶活性顯著性高于對(duì)照組 (p ＜ 0.05)，而 0.02、0.03 和 0.04 μg/g干土處理的土壤蛋白酶活性與對(duì)照組相比存在極顯著性差異 (p＜0.01)。

由圖2可知，染毒后第21 d～42 d，土壤蛋白酶活性在對(duì)照組中基本沒(méi)有波動(dòng)，而處理組中其活性的波動(dòng)具有較大的變化，因此推測(cè)其活性變化與煙堿污染有一定關(guān)系。例如在28 d時(shí)，土壤蛋白酶活性除在 0.012、0.02 μg/g干土處理組接近或略低于對(duì)照組外，其余處理組均顯著性高于對(duì)照組土壤 (p＜0.05);而在35 d 時(shí)，除 0.016 μg/g 干土處理組，其余各處理組均低于對(duì)照組;此外，在42 d時(shí)，0.016 μg/g干土處理組與對(duì)照組接近，0.040 μg/g干土處理組顯著性低于對(duì)照土壤 (p＜0.05)，而其余各處理組土壤蛋白酶活性均顯著性高于對(duì)照土壤 (p＜0.05)。土壤蛋白酶參與調(diào)解生物的氮素代謝，且與土壤氮素循環(huán)有關(guān)［20］，煙堿污染在土壤中的降解也可看成是一類(lèi)氮素循環(huán)的過(guò)程，因此土壤蛋白酶在煙堿污染后期所表現(xiàn)出的受激發(fā)與波動(dòng)特性，都可能與煙堿在土壤中被微生物所降解的過(guò)程有關(guān)。

圖2 尼古丁對(duì)菜地土壤蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of nicotine on the activity of the proteinase in the soil of vegetables fields

2.3 煙堿污染對(duì)土壤脲酶活性的影響

煙堿污染對(duì)土壤脲酶活性的影響如圖3所示。對(duì)照組土壤脲酶活性隨時(shí)間推移逐漸降低并趨于平穩(wěn)，但煙堿污染的各處理組其土壤脲酶活性與對(duì)照組之間存在差異。染毒后7 d時(shí)，較低濃度處理組(煙堿濃度為 0.004、0.008 和 0.012 μg/g 干土)土壤脲酶活性受到激發(fā)，顯著高于對(duì)照土壤，經(jīng)t-檢驗(yàn)p＜0.05。且隨著濃度的降低，脲酶活性呈升高趨勢(shì)，在0.004 μg/g干土處理組土壤脲酶活性極顯著性高于對(duì)照組 (p＜0.01)。較高濃度處理組 (煙堿濃度為 0.016、0.020、0.030 和 0.040 μg/g干土)土壤脲酶活性表現(xiàn)為抑制，且除0.020 μg/g 干土處理組略高于 0.016 μg/g 干土處理外，隨著煙堿污染濃度的升高，土壤脲酶活性顯著降低，其中0.030和0.040 μg/g干土處理組土壤脲酶活性極顯著低于對(duì)照土壤 (p＜0.01)。

隨著染毒培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤脲酶活性除煙堿污染濃度為0.040 μg/g干土處理組幾乎始終低于對(duì)照組 (21 d時(shí)略高于對(duì)照組)，表現(xiàn)為抑制，其余各處理組土壤脲酶活性顯著高于對(duì)照組，表現(xiàn)為刺激。但通過(guò)回歸分析，發(fā)現(xiàn)污染濃度與土壤脲酶活性之間的劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯，R2均小于0.5。由此可以推測(cè)，土壤生態(tài)系統(tǒng)非常復(fù)雜，多種因素可共同作用與影響土壤中脲酶的活性，因而煙堿污染濃度與土壤脲酶活性之間無(wú)明顯線(xiàn)性關(guān)系。

圖3 尼古丁對(duì)菜地土壤脲酶活性的影響Fig.3 Effect of nicotine on the activity of the urease in the soil of vegetables fields

2.4 煙堿污染對(duì)土壤磷酸酶活性的影響

煙堿污染對(duì)土壤磷酸酶活性的影響如圖4所示。由圖4可知，土壤磷酸酶活性在恒溫培養(yǎng)7 d時(shí)有所上升，而后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但各處理組與對(duì)照組之間存在顯著差異。土壤磷酸酶活性除污染濃度為0.040 μg/g干土處理組表現(xiàn)為抑制外，其余各處理組酶活均表現(xiàn)為刺激，且均高于同期對(duì)照組，其中污染濃度為 0.015、0.020 和 0.030 μg/g干土處理組土壤磷酸酶活性與對(duì)照組差異較顯著(p＜0.05)。

在第14 d和第21 d時(shí)，各處理組土壤磷酸酶活性均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。在第14 d各處理組土壤磷酸酶活仍均高于對(duì)照組，到第21 d時(shí)卻表現(xiàn)為顯著或極顯著性低于對(duì)照組。土壤pH值對(duì)土壤磷酸酶活性影響顯著，土壤磷酸酶根據(jù)其對(duì)不同pH的適應(yīng)情況可分為酸性磷酸酶、中性磷酸酶與堿性磷酸酶。有研究證明低酸度對(duì)中性磷酸酶產(chǎn)生一定的先促進(jìn)后抑制效應(yīng)［21］。根據(jù)煙堿污染后土壤磷酸酶活性先刺激后抑制的狀態(tài)，可以推測(cè)這一變化與土壤在煙堿降解中pH由初始的中性而后發(fā)生改變有關(guān)。從第28 d后各處理組土壤磷酸酶活性表現(xiàn)為趨于一致。

圖4 尼古丁對(duì)菜地土壤磷酸酶活性的影響Fig.4 Effect of nicotine on the activity of the phosphatase in the soil of vegetable fields

3 結(jié)論

3.1 土壤過(guò)氧化氫酶活性在煙堿污染條件下與自然條件下 (對(duì)照組土壤)的影響相對(duì)比，呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)勢(shì)態(tài)。開(kāi)始表現(xiàn)為抑制作用，而后為促進(jìn)作用，在抑制、促進(jìn)作用想交替的過(guò)程中，煙堿污染處理組土壤過(guò)氧化氫酶活性的變化與自然條件對(duì)照組始終存在一定的差異。

3.2 煙堿污染影響菜地土壤蛋白酶活性。短期內(nèi)(7 d)抑制土壤蛋白酶活性，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(21 d)較高濃度的煙堿 (0.012～0.040 μg/g 干土)可促進(jìn)土壤蛋白酶活性，煙堿濃度越高，酶活性促進(jìn)的幅度越大。

3.3 短期內(nèi)，較低濃度的煙堿污染處理組 (濃度低于或等于0.012 μg/g干土)，土壤脲酶活性的得到促進(jìn)，且煙堿濃度越低，酶活性促進(jìn)的幅度越大;而較高濃度煙堿 (0.016～0.040 μg/g干土)則表現(xiàn)為對(duì)土壤脲酶活性的抑制。恒溫培養(yǎng)到28～35 d，除了煙堿污染濃度為 0.030 和 0.040 μg/g干土的處理組外，其余各處理組土壤脲酶活性均得到刺激，而后趨于一致。

3.4 煙堿污染對(duì)土壤磷酸酶活性，開(kāi)始表現(xiàn)先刺激后抑制的狀態(tài)，在第7 d和第14 d，各處理組土壤磷酸酶活性大都高于對(duì)照組，在第21 d時(shí)轉(zhuǎn)為抑制，28 d后，各處理組土壤磷酸酶活性與對(duì)照組趨于一致。

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