張躍，翟珂，姜明靜，李蕊，管杰1，

（1山東省腫瘤醫(yī)院，濟南 250117;2濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院;3濟寧市兗州區(qū)人民醫(yī)院）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一［1］，預后較差，進展期胃癌患者術后5年生存率為20% ～50%［2］。胃癌的發(fā)病與多種因素有關。目前已明確與胃癌發(fā)生、發(fā)展關系密切的基因有癌基因e-MET、HER-2、ras及抑癌基因 p53、APC、結直腸癌缺失基因（DCC）、p16等。DCC是目前發(fā)現(xiàn)的最長的抑癌基因，其編碼一種分子量為190 kD的跨膜磷酸化蛋白，是一種信號傳遞受體［3］。研究表明，DCC基因在結直腸癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌及骨肉瘤組織中表達明顯減少或缺失［4～8］，關于其在胃癌組織中的表達報道較少。2014年9月～2015年1月，我們觀察了胃癌組織中DCC mRNA的表達變化，并分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 胃癌患者52例，男34例、女18例;年齡為32～79歲，≥60歲、＜60歲各26例。TNM分期Ⅰ期12例、Ⅱ期6例、Ⅲ期22例、Ⅳ期12例。術中留取胃癌組織與癌旁5 cm以上的正常胃組織標本，將標本置液氮中速凍后，迅速移入-80℃冰箱保存。

1.2 DCC mRNA檢測 ①引物設計與合成:采用Primer BLAST（NCBI）軟件設計 PCR引物，DCC mRNA上游引物序列為 5＇-CACTGCGCTTCCTCTCAGAA-3＇，下游引物序列為 5＇-CTGGCTTGTGGTGTCTGGAA-3＇，擴增產(chǎn)物215 bp;內(nèi)參GAPDH引物設計參考文獻［9］，擴增產(chǎn)物 589 bp。②teal-time PCR反應:提取標本總RNA，合成cDNA;PCR反應體系為10 ×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ExTaq 酶0.125 μL，cDNA模板 3 μL，Nuclease-Free Water定容至 25 μL;PCR反應條件為95℃預變性5 min，（94℃ 30 s，54℃30 s，72℃ 90 s）×32個循環(huán)，72℃終延伸10 min。③結果判定:將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外透射反射儀觀察目的條帶，凝膠圖像分析儀拍照分析;采用凝膠圖像分析軟件AlphaView-SA對圖像進行分析處理，分別得到DCC和GAPDH的積分密度值，扣除背景，得到凈光密度值，DCC mRNA表達量=DCC mRNA凈光密度值/GAPDH凈光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。率的比較采用Fisher確切概率法;不同臨床病理參數(shù)胃癌組織中DCC mRNA相對表達量比較采用t檢驗及方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與正常胃組織中DCC mRNA表達比較 正常胃組織中均檢測到DCC mRNA，陽性表達率100%（52/52）;胃癌組織中DCC mRNA陽性表達率為84.6%;胃癌組織與正常胃組織中DCC mRNA陽性表達率相比，P＜0.05。

2.2 DCC mRNA表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關系有淋巴結轉(zhuǎn)移者胃癌組織中DCC mRNA表達量與無淋巴結轉(zhuǎn)移者相比，Ⅲ、Ⅳ期患者胃癌組織中DCC mRNA表達量與Ⅰ、Ⅱ期患者相比，高、中分化患者胃癌組織中DCC mRNA表達量與低分化患者相比，P均＜0.05。不同性別、年齡、腫瘤部位胃癌組織中DCC mRNA表達量相比，P均＞0.05。詳見表1。

表1 DCC mRNA表達量與胃癌臨床病理參數(shù)的關系（±s）

表1 DCC mRNA表達量與胃癌臨床病理參數(shù)的關系（±s）

臨床病理參數(shù) n DCC mRNA性別男30 0.59 ±0.08 34 0.79 ±0.12女18 0.81 ±0.10年齡＜60 歲 26 0.75 ±0.15≥60 歲 26 0.84 ±0.09腫瘤部位賁門 10 0.85 ±0.13胃體 22 0.78 ±0.10胃竇 20 0.78 ±0.12 TNM分期Ⅰ、Ⅱ期 18 1.21 ±0.11Ⅲ、Ⅳ期 34 0.57 ±0.08淋巴結轉(zhuǎn)移無22 1.07 ±0.10有30 0.59 ±0.08分化程度高分化+中分化 24 1.05±0.10低分化+未分化 28 0.58±0.05淋巴結轉(zhuǎn)移無22 1.07 ±0.10有

3 討論

DCC基因是 Fearon等［10］于1990年首先發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因。DCC基因在腦組織中表達豐富，在結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中表達缺失或下調(diào)。Castets等［11］最新研究發(fā)現(xiàn)DCC蛋白可通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制結腸癌和直腸癌發(fā)展。Mehlen等［12］研究表明，DCC蛋白在配體缺乏的環(huán)境中具有誘導細胞凋亡的作用，但在配體Netorin-1存在時，DCC蛋白則具有抗細胞凋亡作用。如果DCC基因缺失，無法編碼DCC蛋白，將導致細胞生長和分化發(fā)生障礙，細胞有可能發(fā)生惡變［13］。研究［14］表明，DCC 基因在結直腸癌細胞中表達下調(diào)，其失活的主要機制是啟動子甲基化和等位基因缺失。有報道顯示，結直腸癌組織中DCC基因某區(qū)域檢測缺失率為 29%［15］。Zhai等［16］發(fā)現(xiàn)DCC基因在乳腺癌組織中的陽性表達率為38.2%，而在有淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中陽性表達率為23.3%，認為DCC基因表達下調(diào)與乳腺癌的發(fā)生和侵襲有關。DCC mRNA的轉(zhuǎn)錄是DCC基因表達的關鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，DCC mRNA在胃癌組織中的陽性表達率低于正常胃組織，與上述報道結果基本一致。說明胃癌的形成過程中存在DCC基因表達缺失。

本研究結果還顯示，DCC mRNA在有淋巴結轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達量低于無淋巴結轉(zhuǎn)移者，在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期胃癌組織中的表達量低于Ⅰ+Ⅱ期者，在低分化（未分化）胃癌組織中的表達量低于高、中分化者，提示隨著腫瘤分化程度降低、分期增高、淋巴結轉(zhuǎn)移的發(fā)生，DCC mRNA表達逐漸下調(diào)。我們推測，DCC mRNA表達下調(diào)可能是胃癌預后不良的標志;同時，上調(diào)DCC基因表達有可能成為胃癌基因治療的措施之一。

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