智孔亮，辛娜，曹志紅，盧麗敏

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)

智孔亮a，辛娜b，曹志紅a，盧麗敏a

目的：探討細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)及其與泛素表達(dá)的定位關(guān)系。方法：采用不同濃度的MG-132蛋白酶體抑制劑（0、0.5、1、2.5和5μmol/L）處理體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞。處理24 h后，采用In-cellWestern法和Western Blot法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中CD147蛋白的表達(dá)，采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)CD147和泛素的共表達(dá)。結(jié)果：不同濃度的MG-132蛋白酶體抑制劑處理SH-SY5Y細(xì)胞，CD147蛋白的含量呈濃度依賴性增加。當(dāng)抑制劑濃度為5μmol/L時(shí)，CD147的含量明顯高于抑制劑濃度為0μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SH-SY5Y細(xì)胞中同時(shí)存在CD147和泛素的表達(dá)，而且存在共表達(dá)部位。結(jié)論：CD147可能通過泛素-蛋白酶體途徑降解。

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株；泛素-蛋白酶體；

阿爾茨海默?。ˋ lzheimer’s disease，AD）是一種慢性進(jìn)行性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。主要臨床表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知和語(yǔ)言功能障礙以及行為和人格的改變，嚴(yán)重影響患者的工作與生活功能[2,3]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，其主要病理改變表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積[4,5]。近年來，有報(bào)道指出細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147）參與對(duì)Aβ的調(diào)節(jié)，從而影響AD的發(fā)生發(fā)展[6,7]。CD147是一種糖蛋白，在多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、視網(wǎng)膜功能、胚胎發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)[8]。在真核生物中，細(xì)胞主要通過泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome system，UPS）降解蛋白質(zhì)。若UPS途徑功能異常，則會(huì)引起蛋白降解失衡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[9,10]。有研究指出[11]，異常的UPS途徑與AD的病理密切相關(guān)。此外，早老素（Presenilin-1，PS1）、早老蛋白增強(qiáng)子-2（Presenilin enhancer-2，PEN-2）等與Aβ產(chǎn)生緊密相關(guān)的蛋白均經(jīng)UPS途徑降解[12-13]，但是參與Aβ調(diào)節(jié)的CD147是否也與UPS途徑相關(guān)還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過探討CD147的降解途徑，旨在增進(jìn)對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，從而為AD的治療提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y）（由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS，購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司），MG-132蛋白酶體抑制劑（購(gòu)于美國(guó)Biosciences公司），兔抗CD147和小鼠抗CD147（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司），兔抗泛素（購(gòu)于英國(guó)Abcam公司），山羊抗兔和山羊抗小鼠熒光二抗（購(gòu)于美國(guó)Rockland公司），Hoechst33342DNA染色劑（購(gòu)于法國(guó)Sanofi-Aventis公司），雙色紅外激光成像儀（購(gòu)于美國(guó)Licor公司）。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、青霉素105IU/L、鏈霉素100mg/L的DMEM高糖培養(yǎng)基，維持37℃和5%CO2。細(xì)胞融合到85%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化，傳代。

1.2.2 In-cellWestern檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞CD147蛋白表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，平均接種于96孔培養(yǎng)板，各組間細(xì)胞密度保持一致。培養(yǎng)48 h后，更換含有MG-132蛋白酶體抑制劑的培養(yǎng)基，各組MG-132蛋白酶體抑制劑的濃 度 分 別 設(shè) 定 為 0、0.5、1、2.5和5μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后，取出培養(yǎng)板，移液槍小心吸出培養(yǎng)基，PBS清洗3次。每孔加入200μL 3.7%的甲醛固定液，固定30m in。小心吸出固定液，每孔加入200μL的Triton洗脫液，輕搖洗滌5min，重復(fù)4次。37℃封閉1 h，加入一抗4℃下孵育過夜。第二天，吐溫20洗脫液洗脫3次，每次5m in。加入山羊抗兔和山羊抗小鼠熒光二抗，37℃下孵育1 h。去除二抗，加入吐溫20洗脫液洗脫3次，每次5m in。采用雙色紅外激光成像儀測(cè)量吸光度值。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞CD147蛋白表達(dá) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，平均接種于6孔培養(yǎng)板，各組間細(xì)胞密度保持一致。培養(yǎng)72 h后，更換含有MG-132蛋白酶體抑制劑的培養(yǎng)基，各組MG-132蛋白酶體抑制劑的濃度分別設(shè)定為0、0.5、1、2.5和5μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后，取出培養(yǎng)板置于冰上，移液槍小心吸出培養(yǎng)基，PBS清洗3次。每孔加入RIPA細(xì)胞裂解液400μL，裂解30m in，小心刮離細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管。4℃下裂解1 h后，20 000 r/m in，離心30m in，取上層清液于－20℃保存?zhèn)溆??？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定所提取蛋白的濃度。分別取50μg的等量總蛋白上樣，恒壓80 V過濃縮膠，恒壓120 V分離膠電泳。PVDF膜恒壓80 V轉(zhuǎn)膜2 h，取出轉(zhuǎn)移膜用TBST緩沖液小心淋洗3次，考馬斯亮藍(lán)檢查蛋白是否轉(zhuǎn)移完全。5%的脫脂牛奶37℃封閉1 h，4℃下加入一抗孵育過夜。第2天，TBST緩沖液淋洗3次，每次10m in。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃下孵育1 h。1 h后，TBST緩沖液淋洗3次，每次10min，DAB顯色。采用圖像分析軟件，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，進(jìn)行光密度值分析。

1.2.4 免疫熒光雙標(biāo)法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，平均接種于24孔培養(yǎng)板，各組間細(xì)胞密度保持一致。培養(yǎng)72 h后，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗3次。每孔加入4%的多聚甲醛固定30m in，PBS淋洗3次。每孔加入10%的山羊血清37℃封閉1 h，加入泛素一抗和CD147一抗4℃下孵育過夜，陰性對(duì)照采用PBS緩沖液代替。第2天，PBS緩沖液淋洗3次，每次10min。加入山羊抗兔和山羊抗小鼠熒光二抗，37℃下孵育1 h。Hoechst33342 DNA染色劑于37℃染色10m in。PBS緩沖液淋洗3次，每次10m in。最后90%甘油封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 In-cellWestern檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞CD147蛋白表達(dá)

In-cellWestern檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的MG-132蛋白酶體抑制劑（0、0.5、1、2.5和5μmol/L）處理SH-SY5Y細(xì)胞，CD147蛋白的含量呈濃度依賴性增加。其中，當(dāng)MG-132蛋白酶體抑制劑濃度為5μmol/L時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞CD147蛋白含量增加，高于0μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1，提示CD147有可能經(jīng)過蛋白酶體途徑降解。

圖1 In-cellWestern檢測(cè)CD147蛋白的含量

2.2 Western Blot檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞CD147蛋白表達(dá)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MG-132蛋白酶體抑制劑濃度分別為0、0.5、1、2.5、5μmol/L時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞中CD147蛋白的含量分別為 （18.13± 0.09）、（19.51±0.12）、（25.30± 0.11）、（32.12± 0.12）、（44.51±0.13）μg/μL；SH-SY5Y細(xì)胞中CD147蛋白的含量，隨MG-132蛋白酶體抑制劑濃度的增大而增加，見圖2。其中，當(dāng)MG-132蛋白酶體抑制劑濃度為5μmol/L時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞CD147蛋白含量增加高于0μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示CD147有可能經(jīng)過蛋白酶體途徑降解。

2.3 免疫熒光雙標(biāo)法

免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示，SH-SY5Y細(xì)胞中同時(shí)存在CD147和泛素表達(dá)，而且存在共表達(dá)部位，見圖3，提示CD147可能被泛素化。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)泛素和CD147的共定位（免疫熒光染色，×400）

3 討論

AD的病因迄今不明，一直以來都認(rèn)為AD是由多種因素導(dǎo)致的復(fù)雜性異質(zhì)性疾病，如遺傳、免疫和環(huán)境因素等[14,15]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，AD的主要特征性病理改變表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ沉積。換而言之，當(dāng)Aβ的生成和降解失衡時(shí)，Aβ在腦內(nèi)異常沉積，進(jìn)而引起AD。近年來，有報(bào)道指出細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子參與對(duì)Aβ的調(diào)節(jié)，從而影響AD的發(fā)生發(fā)展。在真核生物中，80%以上的蛋白質(zhì)，還有大部分突變蛋白或損傷蛋白均通過UPS途徑降解。特別指出的是，突變蛋白或損傷蛋白異常沉積通常會(huì)引起AD和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病[16]。因此，UPS途徑與AD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。此外，早老素、早老蛋白增強(qiáng)子-2等與Aβ產(chǎn)生緊密相關(guān)的蛋白均經(jīng)UPS途徑降解，但是參與對(duì)Aβ調(diào)節(jié)的CD147是否也與UPS途徑相關(guān)還不十分清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的MG-132蛋白酶體抑制劑對(duì)體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞的UPS途徑進(jìn)行干預(yù)，以觀察CD147的降解是否與蛋白酶體途徑有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的MG-132蛋白酶體抑制劑處理SH-SY5Y細(xì)胞，CD147蛋白的含量呈濃度依賴性增加。由此提示，CD147很可能通過蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。此外，經(jīng)過UPS途徑降解的蛋白首先必須被泛素化。因此，還必須檢測(cè)CD147是否被泛素化，才能進(jìn)一步確定CD147是否是通過UPS途徑降解。為此，本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)CD147和泛素的共表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞中同時(shí)存在CD147和泛素的表達(dá)，而且存在共表達(dá)部位，提示CD147可能被泛素化。本實(shí)驗(yàn)通過探討CD147的降解途徑，發(fā)現(xiàn)CD147可能通過UPS途徑降解，若該途徑功能異常，則會(huì)引起CD147降解失調(diào)。

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（本文編輯：王晶）

Expression of Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer in SH-SY5Y Cells

ZHIKong-liang, XIN Na,CAO Zhi-hong,LU Li-min.Department of Neurology,The First Hospital of Handan City,Hebei056002, China

Objective: To investigate the expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in SH-SY5Y cells and the spacial relationship with the expression of ubiquitin. Methods: Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y was treated with MG-132 proteasome inhibitors at different concentrations (0, 0.5, 1, 2.5 and 5 μmol/L) in vitro. After 24 h, In-cell Western and Western Blot methods were employed to detect the expression of CD147 protein. Immunofluorescence double labeling method was used to detect the co-localization of ubiquitin and CD147. Results:When MG-132 proteasome inhibitors were used to deal with SH-SY5Y cultured in vitro, The expression of CD147 protein in SH-SY5Y cells was increased with MG-132 proteasome inhibitors in a concentration dependent manner. When the inhibitor concentration was 5 μmol/L, the expression of CD147 was significantly higher than that in the control (0 μmol/L) (P＜0.05). The expressions of Ubiquitin and CD147 were co-localized in SH-SY5Y cells. Conclusion: CD147 may be degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.

extracellular matrix metalloproteinase inducer; SH-SY5Y; ubiquitin-proteasome system

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.06.002

邯鄲市第一醫(yī)院a.神內(nèi)一科b.骨三科 河北邯鄲056002

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.1423108130）

2015-04-02

智孔亮 zhikongliangq@163.com