郝振林, 劉京哲, 唐雪嬌, 湛垚垚, 田 瑩, 丁 君, 楊立猛, 常亞青

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

顏色作為可穩(wěn)定遺傳性狀, 已在動植物的遺傳育種中進行了大量研究并得到廣泛應(yīng)用。在海產(chǎn)經(jīng)濟動物中, 體色常與生長指標相結(jié)合用于育種的研究中[1]。Winkler等[2-3]通過對紫扇貝和海灣扇貝研究發(fā)現(xiàn), 殼色與扇貝的生長情況密切相關(guān); 劉曉[4]等對皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)紅殼色突變體進行定向選育和遺傳改良, 育成了“中國紅”品系; 中國海洋大學(xué)包振民教授帶領(lǐng)團隊采用雜交、選育和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法, 培育出櫛孔扇貝新品種“蓬萊紅”;何毛賢[5]等在我國的馬氏珠母貝(Pinctada martensii)群體中選育出了優(yōu)良品系“南科珍珠紅”。

蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)為大型冷水性雙殼貝類, 于20世紀80年代初由日本青森縣引入我國, 現(xiàn)已在遼寧、山東等地進行規(guī)模化養(yǎng)殖, 是我國北方沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一[6]。近年來,蝦夷扇貝出現(xiàn)了大規(guī)模死亡現(xiàn)象, 特別在夏季, 死亡率明顯增加, 給經(jīng)營者帶來巨大的經(jīng)濟損失[7-8]。主要原因在于養(yǎng)殖所用苗種都未經(jīng)過人工定向選育,其遺傳基礎(chǔ)尚屬野生型, 抗逆能力乃至品質(zhì)質(zhì)量未達到良種化程度, 因此良種問題已成為制約我國蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的主要“瓶頸”之一, 是蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)中亟需解決的關(guān)鍵問題。本課題組經(jīng)過長期選育, 培育出蝦夷扇貝“象牙白”品系, 其特征是其左右殼均為白色[9], 且在浮筏養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn), 蝦夷扇貝“象牙白”品系具有較高的抗逆能力, 尤其是在度夏過程中, 表現(xiàn)出對高溫具有良好的抵抗力和耐受力。楓葉貝是本課題組以雙白殼蝦夷扇貝及普通的紅褐色蝦夷扇貝為親貝, 通過單交和群交及相應(yīng)的培育方法, 培育獲得殼面具有紅白花圖案的蝦夷扇貝新品系[10], 紅貝選用生產(chǎn)中使用的野生種群扇貝作為對照組。本研究以楓葉貝、紅貝(對照組)和白貝(蝦夷扇貝“象牙白”品系)3種殼色蝦夷扇貝為材料,比較分析了 3種殼色蝦夷扇貝在高溫水平下的生理代謝、酶學(xué)及熱激蛋白 HSP70的表達變化, 旨在了解不同殼色蝦夷扇貝對高溫的耐受能力, 為后期進行耐高溫型蝦夷扇貝新品系的培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3種殼色蝦夷扇貝分別為楓葉貝(F)、紅貝(H)和白貝(B), 殼長48.30 mm±5.98 mm, 殼高49.10 mm±5.87 mm, 殼寬 11.47 mm±3.16 mm, 濕質(zhì)量 14.45 g±5.02 g, 軟體部干質(zhì)量0.49 g±0.10 g。潮濕狀態(tài)下運到大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,暫養(yǎng)于可控溫獨立循環(huán)品字形水槽內(nèi)。暫養(yǎng)溫度15 ℃±1 ℃, 鹽度 30左右, 實驗期間每天 09:00和18:00投喂螺旋藻粉和鼠尾藻粉, 連續(xù)充氣, 每天換1/3水量, 馴養(yǎng)14 d后, 挑選活力較強的健康扇貝進行實驗。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

將在15℃暫養(yǎng)的3種殼色蝦夷扇貝分別馴化至20, 22, 24 和26℃ 4個溫度梯度(升溫幅度為1 ℃/d),待各處理組達到對應(yīng)溫度梯度后暫養(yǎng)7 d, 每個溫度梯度設(shè)有3個平行, 每個平行放楓葉貝、紅貝和白貝各 8只(其中在不同溫度處理組間, 以 15 ℃處理組作為對照組)。每天記錄扇貝死亡情況。

1.3 樣品分析

1.3.1 耗氧率和排氨率測定

每個溫度梯度分別取3種殼色貝各1只, 采用靜水密封法測其耗氧率和排氨率, 連續(xù)測3 d。將完好的4 L自封袋(確保嚴格密封)放入水槽中, 灌入一定體積的海水, 并放入一只蝦夷扇貝, 虹吸采水。虹吸前用手輕輕揉捏自封袋, 使各處溶氧及氨氮保持一致, 實驗持續(xù)2 h。采用(Winkler)碘量法檢測水體溶解氧(DO)含量, 次溴酸鈉氧化法檢測氨氮(NH4-N)排泄率。根據(jù)實驗前后溶解氧的濃度變化計算單位干質(zhì)量耗氧率:

RO＝[C0(DO)－Ct(DO)]V/Wt

C0(DO)和 Ct(DO)分別為實驗開始和結(jié)束時實驗水中DO質(zhì)量濃度(mg/L), V為實驗用水的體積(L), W為實驗貝軟組織干質(zhì)量(g), t為實驗持續(xù)時間(h)。

根據(jù)實驗前后氨氮的濃度變化計算單位干質(zhì)量氨氮排泄率:

RN＝[Ct(N)－C0(N)]V/Wt

C0(N)和 Ct(N)分別為實驗開始和結(jié)束時實驗水中氨氮濃度(μmol/L), V為實驗用水的體積(L), W為實驗貝軟組織干質(zhì)量(g), t為實驗持續(xù)時間(h)。

1.3.2 生理指標測定

用一次性1 mL注射器抽取達到各溫度梯度后暫養(yǎng)7 d的蝦夷扇貝閉殼肌內(nèi)的血竇血液(從每個處理組的3個平行中, 每種殼色隨機取1只扇貝, 用于抽取血液), 注入冰浴的2 mL離心管中, 4 ℃下4 500 r/min離心10 min后, 取上清液保存于–80 ℃冰箱中備用。采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質(zhì)含量。總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性以及超氧化物歧化酶(SOD)活性均使用南京建成生物公司的試劑盒測定, 并嚴格按照說明書步驟進行。

1.3.3 HSP70的定量表達

1.3.3.1 總RNA提取和cDNA合成

參照動物組織總 RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)操作步驟分別提取處理溫度為15 ℃和26 ℃并適應(yīng)7 d后依然存活的不同殼色蝦夷扇貝鰓的總 RNA, 經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用 Implen NanoPhotometer 核酸蛋白分析儀(德國)檢測其純度和濃度, 將樣品保存于–80 ℃?zhèn)溆?。用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒( TaKaRa, 中國大連)獲得單鏈cDNA, 反轉(zhuǎn)錄PCR體系為20 μL, 包含 4 μL 5 × PrimeScriptTMbuffer, 5 μL Total RNA, 2 μL Oligo dT Primer(50μmol), 2 μL random 6 mers(100 μmol), 2 μL PrimeScriptTMRT enzyme Mix I, 5 μL RNase Free ddH2O。樣品混勻后于 PCR 儀進行反轉(zhuǎn)錄, 37 ℃ 15 min; 85 ℃ 5 s。

1.3.3.2 RT-PCR

利用Primer 5.0 設(shè)計HSP70和細胞色素b (cytochrom b, Cyt b) 的引物 (表1), 檢測其引物特異性和擴增效率。用以檢測 HSP70的表達量。利用RT-PCR研究不同殼色蝦夷扇貝在高溫26℃暫養(yǎng)7 d后HSP70的表達量, 所用儀器為 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system(Life Technologies, USA),試劑盒為 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit(Tli RNaseH Plus, TaKaRa)。反應(yīng)體系為 20 μL, 包含 10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus),0.4 μL ROX Reference DyeⅡ, 2 μL cDNA 模板, 上下游引物(10 μmol)各 0.8 μL, ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s; 35個循環(huán)的 95 ℃ 5 s, 58 ℃ 30 s;溶解曲線階段 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行單因子方差分析(One-way ANOVA)和組間多重比較分析(LSD), 不同殼色間進行獨立樣本 T檢驗, 顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 存活率

不同高溫水平下3種殼色蝦夷扇貝存活率如圖1所示。隨溫度升高, 3種殼色蝦夷扇貝存活率均呈下降趨勢, 其中在15～22 ℃處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝存活率均大于90%, 且差異不顯著(P>0.05), 另外,在同一溫度處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝之間的存活率差異也不顯著(P>0.05)。在 26 ℃處理組下, 楓葉貝和紅貝存活率均顯著降低(P<0.05), 且在同一溫度處理組下, 不同殼色蝦夷扇貝的存活率也存在差異,在5個溫度處理組中, 3種殼色扇貝的存活率始終為白貝>紅貝>楓葉貝, 其中 26℃時楓葉貝的存活率最低為67%。

2.2 耗氧率和排氨率

2.2.1 耗氧率

不同高溫水平下 3種殼色蝦夷扇貝的耗氧率見圖1。隨溫度升高, 3種殼色蝦夷扇貝耗氧率均呈先上升后下降趨勢, 除 15 ℃和 26 ℃處理組外, 各溫度處理組間差異顯著(P<0.05)。其中在15～24 ℃處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝耗氧率隨溫度逐漸升高, 且在 24 ℃時達到最高, 楓葉貝為 1.53 mg/(g·h), 紅貝 1.17 mg/(g·h) 和白貝 1.71 mg/(g·h); 26 ℃時, 耗氧率顯著降低。另外, 在同一溫度處理組中, 3種殼色貝耗氧率也存在差異, 白貝的耗氧率始終高于紅貝和楓葉貝。

2.2.2 排氨率

圖1 不同溫度下3種殼色蝦夷扇貝的存活率、耗氧率、排氨率Fig.1 The survival rate, oxygen consumption rate and ammonia excretion rate for 3 kinds of shell colors M.yessoensis in different temperature groups

不同高溫水平下 3種殼色蝦夷扇貝排氨率的變化趨勢與耗氧率相似(圖 1)。在 15～24 ℃處理組下,隨溫度升高, 3種殼色蝦夷扇貝耗氧率逐漸上升, 并在 24 ℃時達到最大, 楓葉貝為 4.23 μmol/(g·h)、紅貝和白貝分別為 4.00 μmol/(g·h)和 4.39 μmol/(g·h)。26 ℃時, 3種殼色蝦夷扇貝排氨率均降至最低。另外,在同一溫度處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝排氨率存在差異, 排列順序為白貝>紅貝>楓葉貝。

2.3 免疫酶活力

2.3.1 CAT

不同高溫水平下 3種殼色蝦夷扇貝的過氧化氫酶(catalase, CAT)活力變化如圖2所示。15～24 ℃處理組下, 隨著溫度的升高, 3種殼色蝦夷扇貝的 CAT活力均呈上升趨勢, 且在 24 ℃時達到最高。當(dāng)溫度升高到26 ℃時, 蝦夷扇貝的CAT活力快速下降, 顯著低于其他處理組 15 ℃(P<0.05)。另外, 在同一溫度處理組下, 白貝的CAT活力始終高于楓葉貝和紅貝。

圖2 不同溫度下3種殼色蝦夷扇貝的CAT活力、T-AOC活力、POD活力和SOD活力Fig.2 The CAT, T-AOC, POD and SOD for 3 kinds of shell colors M.yessoensis in different temperature groups

2.3.2 T-AOC

不同高溫活力下 3種殼色蝦夷扇貝的總抗氧化能力(total-antioxidant capacity, T-AOC)活力如圖2所示。在不同高溫下, 3種殼色蝦夷扇貝CAT活力的變化趨勢相同, 隨著溫度升高, 蝦夷扇貝的 T-AOC活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 在 24 ℃處理組下,T-AOC活力升至最高, 分別為楓葉貝0.69 U/mL, 紅貝0.73 U/mL, 白貝0.87 U/mL, 在26 ℃時降至最低:楓葉貝0.33 U/mL, 紅貝0.39 U/mL, 白貝0.05 U/mL,且3種殼色扇貝在同一溫度處理組下的T-AOC活力始終為白貝>紅貝>楓葉貝。

2.3.3 POD

不同高溫水平下 3種殼色蝦夷扇貝的過氧化物酶(peroxidase, POD)活力如圖2所示。隨著溫度升高,3種殼色蝦夷扇貝的POD活力均呈先上升后下降的趨勢, 并在24 ℃時達到最高值。26 ℃處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝POD活力最低分別為: 楓葉貝1.66 U/mL,紅貝2.07 U/mL, 白貝2.57 U/mL, 同一溫度處理組下,白貝的POD活力始終顯著高于紅貝和楓葉貝。

2.3.4 SOD

不同高溫水平下 3種殼色蝦夷扇貝的超氧化物歧化酶(activity of superoxide dismutase, SOD)活力變化如圖2所示。隨著溫度升高, 3種殼色蝦夷扇貝的SOD活力均呈先上升后下降的趨勢。其中楓葉貝、紅貝和白貝體腔液中SOD活力均在24℃溫度處理組下最高, 分別為4 825 U/mL, 5 249 U/mL, 7 199 U/mL,并在26℃時降至最低, 楓葉貝2 818 U/mL, 紅貝3 175 U/mL, 白貝3 600 U/mL。同一溫度處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝的SOD活力大小為: 白貝>紅貝>楓葉貝。

2.4 HSP70的特異性表達

不同高溫水平下3種殼色蝦夷扇貝鰓的HSP70表達量變化如圖3所示。隨著溫度升高, 3種殼色蝦夷扇貝的HSP70的表達量均逐漸升高, 其中15～22 ℃時, HSP70表達量差異不顯著(P＞0.05), 24～26℃溫度處理組下, 蝦夷扇貝鰓的 HSP70表達量差異也不顯著(P>0.05)。同一溫度處理組下, 不同殼色蝦夷扇貝HSP70表達量大小為白貝>紅貝>楓葉貝(P>0.05)。

圖3 不同溫度下3種殼色蝦夷扇貝HSP70的表達量Fig.3 HSP70 for 3 kinds of shell colors M.yessoensis in different temperature groups

3 討論

3.1 存活率

蝦夷扇貝是大型冷水性雙殼貝類, 早期文獻記載蝦夷扇貝的耐溫上限為 23 ℃, 超過 23 ℃時蝦夷扇貝代謝活動緩慢, 基本處于不攝食狀態(tài), 從而導(dǎo)致機體消瘦, 最后死亡, 其中 15 ℃是蝦夷扇貝最適生長溫度[11-12]。本研究結(jié)果與之相符, 在15～22 ℃處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝存活率均大于90%, 在24～26 ℃處理組下, 3種殼色蝦夷扇貝存活率均顯著降低。另外, 在本研究中, 蝦夷扇貝在24～26 ℃處理組下的存活率較作者以前報道的此溫度下蝦夷扇貝的存活率略存在差異[13-15], 分析認為出現(xiàn)差異的原因可能與實驗過程中選取的蝦夷扇貝的健康狀態(tài)、個體大小有關(guān)。此外, 本研究還發(fā)現(xiàn), 白殼色蝦夷扇貝在26 ℃高溫下的存活率顯著高于其他殼色, 這與鄭懷平等報道的殼色較淺的海灣扇貝具有較強的耐高溫能力的研究結(jié)果相似[16]。Newkirk[17]認為淺殼色貝類在高溫下表現(xiàn)出較高的存活率可能是因為淺殼色貝類在高溫季節(jié)吸收光和熱較少的緣故, 而關(guān)于其具體原因尚待于進一步研究。

3.2 耗氧率與排氨率

目前, 耗氧率和氨氮排泄率已經(jīng)被認為是評估水產(chǎn)動物在不同脅迫環(huán)境中利用蛋白和能量的有效指標[18-19]。由簡單能量平衡公式P=A–R(P為生長; A為消化吸收; R為呼吸作用)可知, 假定餌料的消化吸收與溫度無關(guān), 呼吸代謝升高則生長下降, 呼吸代謝降低則生長增加[20]。而溫度可能是影響蝦夷扇貝代謝率最明顯的環(huán)境因子[21]。本文研究發(fā)現(xiàn), 蝦夷扇貝的耗氧隨溫度升高先升高再降低, 這說明蝦夷扇貝在15 ℃的環(huán)境中耗能少, 更多的能量則用于生長, 因此, 15 ℃是蝦夷扇貝最適生長溫度, 這與早期研究結(jié)果相一致[11-12]。26 ℃時, 雖然蝦夷扇貝耗氧率也較低, 但此時已超過扇貝的耐溫上限, 其代謝活動非常微弱, 基本處于不攝食狀態(tài), 因此耗氧率雖然低, 但生長緩慢。另外, 蝦夷扇貝的排氨率隨溫度升高表現(xiàn)為先增加后下降的趨勢。這說明在適宜溫度下, 溫度升高能夠加速蛋白和氨基酸的分解代謝, 因此導(dǎo)致氨氮排泄升高。這與雙殼濾食性貝類中的墨西哥灣扇貝[22]、櫛孔扇貝[23]和硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)[24]隨溫度的變化情況相似。另外, 本研究還發(fā)現(xiàn), 在同一高溫處理下, 白殼色蝦夷扇貝的耗氧率和排氨率數(shù)值較其他兩種殼色的蝦夷扇貝偏高。同樣, 王慶恒[25]在馬氏珠母貝得到相似的研究結(jié)果, 他發(fā)現(xiàn), 在高溫下, 黃殼色品馬氏珠母貝的耗氧率和排氨率均大于其他殼色系, 這表明淺殼色貝類在高溫下表現(xiàn)出較強的高溫耐受性。

3.3 免疫酶活力

當(dāng)生物體遇到外界不良環(huán)境刺激時, 會導(dǎo)致機體內(nèi)活性氧自由基積聚過多, 進而造成細胞膜的損壞, 影響細胞正常功能的發(fā)揮[26]。在長期的進化過程中, 生物體內(nèi)形成了一套能夠及時有效清除活性氧自由基的反應(yīng)機制, 使其生成與清除始終處于動態(tài)平衡[26]。SOD 和 CAT 就是這個清除體系中的重要成員[26-28]。SOD 可將生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧轉(zhuǎn)化為H2O2, 并由CAT 分解成H2O和O2[29]。POD 一般在衰老組織中可檢測出較高的活性, 檢測生物體內(nèi) POD的活力變化能比較準確地反映機體的免疫力[30]。而T-AOC 活力的高低能夠反應(yīng)機體抗氧化系統(tǒng)對外界刺激的總應(yīng)激能力[31]。

高溫對動物的傷害途徑之一是氧化脅迫[32]。脅迫初期, 扇貝體內(nèi)的活性氧清除系統(tǒng)被激活, 因此在本研究中, 15～24℃處理組時, T-AOC、SOD、CAT和POD 四者的活性均不斷升高并在24 ℃時達到最高, 隨著脅迫溫度的升高, 各種抗氧化酶活性開始降低, 扇貝存活率也顯著降低, 這與26 ℃時的低存活率研究結(jié)果相吻合。另外, 在同一高溫處理組下,白殼色蝦夷扇貝較其他兩種殼色具有較高的免疫酶活力, 這說明白殼色蝦夷扇貝在高溫下表現(xiàn)出較強的耐受性。此外, 閆喜武等[33]在對菲律賓蛤仔進行研究時也發(fā)現(xiàn), 高溫下殼色較淺的斑馬蛤品系比殼色較深的兩道紅品系具有較高的存活率和較強的抗逆性, 這與本研究結(jié)果相似。

3.4 HSP70在溫度脅迫下的表達

熱休克蛋白作為分子伴侶可以幫助變性蛋白重新復(fù)性和新合成蛋白的折疊, 是高度保守的家族,另外還參與蛋白分泌、降解等過程[34]。而HSP70作為已知熱休克蛋白家族中最重要的一種, 對于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài), 緩解機體所受到的應(yīng)激損傷有重要作用, 生物受到熱脅迫時, 其在細胞內(nèi)的大量表達和積累可以明顯改善細胞的生存能力, 提高對環(huán)境脅迫或傷害的耐受性[35]。

Snyder[34]等發(fā)現(xiàn), 暴露于高熱和化學(xué)藥品超標的水體中的紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)和紅鮑螺(Haliotis rufescens), 其體內(nèi)的 HSP70、HSP60和HSP90含量均發(fā)生顯著變化。從生活習(xí)性看, 貝類是濾食性生物, 其伸展于水體中的鰓片鰓絲富含觸覺細胞, 比其它組織能更直接地感應(yīng)到環(huán)境中水流、溫度、重金屬離子濃度等的變化, 并迅速做出應(yīng)答。曲凌云等[36]通過熱刺激櫛孔扇貝, 對 HSP70表達跟蹤檢測結(jié)果顯示, 受高溫刺激后, 扇貝鰓中的 HSP70表達量明顯升高。洪美玲[37]等在探討中華絨螯蟹在亞硝酸鹽急性脅迫過程中的應(yīng)對策略時發(fā)現(xiàn), 水中亞硝酸鹽濃度越高, HSP70最大表達量越大, 進而預(yù)測HSP70表達量的變化可作為一種較為敏感的早期應(yīng)激評價指標應(yīng)用于亞硝酸鹽脅迫評價中。本研究在高溫處理后對不同殼色蝦夷扇貝鰓HSP70進行定量表達研究時發(fā)現(xiàn), 白殼色蝦夷扇貝的相對表達量顯著高于其他兩種殼色蝦夷扇貝。由此我們推斷, 在受到高溫脅迫時, 與其他殼色的蝦夷扇貝相比, 白殼色蝦夷扇貝體內(nèi)的 HSP70會更多地表達和積累,從而使其對高溫具有更好的耐受性。

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