韋國(guó)建 , 劉文廣 林堅(jiān)士 何毛賢

(1. 中國(guó)科學(xué)院 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的多數(shù)重要經(jīng)濟(jì)性狀例如生長(zhǎng)、抗逆和肉質(zhì)等都是數(shù)量性狀, 不僅由多個(gè)基因控制,且易受環(huán)境等因素的影響[1]。挖掘數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait locus, QTL)的最終目的是利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種(marker-assisted selection, MAS), 從而促進(jìn)對(duì)性狀的遺傳改良[2]。目前遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和 QTL定位在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中取得了較大的進(jìn)展, 但是這些QTL一般是基于單個(gè)家系小樣本量作圖獲得的,QTL區(qū)間過大, 導(dǎo)致QTL的檢測(cè)效率和對(duì)QTL效應(yīng)的評(píng)估發(fā)生偏離[3]。因此對(duì)挖掘到的 QTL作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定是實(shí)施MAS的前提。QTL驗(yàn)證最簡(jiǎn)單的方法是比較QTL位點(diǎn)不同等位基因的表型差異[3-4]。目前對(duì) QTL定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證的報(bào)道還不是很多,在尖吻鱸[5]、虹鱒[6-8]、鯉魚[9-11]、大西洋鮭魚[12]和牙鲆[13-14]等少數(shù)魚類的生長(zhǎng)和抗病 QTL進(jìn)行了確認(rèn),并且已有少數(shù)QTL結(jié)果應(yīng)用于指導(dǎo)實(shí)踐育種[12,14-16]。而在海洋貝類, 還極少見對(duì) QTL進(jìn)一步驗(yàn)證和應(yīng)用的報(bào)道。

馬氏珠母貝(Pinctada martensii)是重要海水養(yǎng)殖貝類。最近, 利用遺傳圖譜獲得了與其生長(zhǎng)性狀連鎖的QTL標(biāo)記, Shi等[17]應(yīng)用2b-RAD測(cè)序技術(shù), 利用3117個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建了馬氏珠母貝遺傳圖譜, 獲得6個(gè)與總重、殼長(zhǎng)、絞合線和珍珠層厚度相關(guān)的QTL。Li等[18]利用 RAD測(cè)序構(gòu)建遺傳圖譜獲得與馬氏珠母貝殼高、殼長(zhǎng)、殼寬、殼重、軟體部重、絞合線和總重7個(gè)生長(zhǎng)性狀連鎖的QTL。但目前還沒有對(duì)這些QTL作進(jìn)一步的驗(yàn)證和應(yīng)用。本研究用2個(gè)不同遺傳背景的馬氏珠母貝群體對(duì)其中兩個(gè)QTL(154165和 m59)進(jìn)行驗(yàn)證, 評(píng)估 QTL不同基因型與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性, 旨在獲得真實(shí)穩(wěn)定的 QTL結(jié)果, 為開展基于QTL結(jié)果的MAS奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)群體

本實(shí)驗(yàn)所用的馬氏珠母貝(Pinctada martensii)來自深圳養(yǎng)殖群體(211只)和湛江養(yǎng)殖群體(111只), 均為2貝齡, 來源于同期貝苗, 養(yǎng)殖于深圳大鵬澳海區(qū),以同樣的管理?xiàng)l件及相同的養(yǎng)殖密度進(jìn)行養(yǎng)殖。用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄每只貝的殼高、殼長(zhǎng)和殼寬, 精確到0.01 mm; 用電子天平稱量每只貝的總重, 精確到0.01 g。分別取每只貝的鰓組織置于95%的乙醇中,–20℃保存。

1.2 基因組DNA的提取

使用 DNA提取試劑盒(Hipure Universal DNA Kit)提取鰓組織的基因組 DNA, 相關(guān)操作參照試劑盒說明書。提取DNA后, 于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性; 并用分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。提取的DNA于–20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)

已獲得的 QTL連鎖標(biāo)記所在的序列為短序列,其長(zhǎng)度無法用來設(shè)計(jì)引物。因此以連鎖標(biāo)記的序列為源序列, 在已公布的馬氏珠母貝基因組草圖(http://marinegenomics.oist.jp/)和本實(shí)驗(yàn)室已有的馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì), 找出與之匹配的序列。根據(jù)匹配的序列和QTL標(biāo)記SNP位置, 利用Primer Primer5.0軟件和Tetra-primer ARMS在線引物設(shè)計(jì)程序(http: //primer1.soton.ac.uk/primer1.html)設(shè)計(jì)每個(gè) QTL標(biāo)記 SNP基因分型的特異引物(表 1)。

表1 QTL位點(diǎn)SNP分型引物Tab.1 Primer used for analysis of QTL in pear oyster Pinctada martensii

1.4 PCR擴(kuò)增

采用等位基因特異 PCR(AS-PCR)法對(duì)樣品的QTL標(biāo)記SNP進(jìn)行基因分型。15 μL的PCR反應(yīng)體系為: 1.5 μL10×PCR buffer, 1.5 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L), 0.15 μLTaq DNA 聚合酶(5 U/μL), 1μL內(nèi) 引 物(10 μmol/L), 0.5μL 外 引物(10 μmol/L),0.5 μLDNA, 8.35 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán); 最后 72℃延伸 5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用 SPSS19.0軟件中一般線性模型(GLM)進(jìn)行QTL連鎖標(biāo)記SNP及其二倍型與馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性。采用Duncan,s多重比較分析各基因型、二倍型差異的顯著性, 差異顯著為P<0.05。方差分析的數(shù)學(xué)模型為:Yij=u+GiorDi+eij, 其中Yij表示基因型為i的第 j個(gè)個(gè)體的指標(biāo),u表示總體均值,Gi表示第i種基因型的效應(yīng),Di表示第i種二倍型的效應(yīng)eij表示隨機(jī)誤差變量。

2 結(jié)果與分析

2.1 QTL連鎖標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的驗(yàn)證

m59和154165QTL標(biāo)記在湛江養(yǎng)殖群體和深圳養(yǎng)殖群體中都可檢測(cè)出3種基因型。經(jīng)SPSS19.0軟件的一般線性模型(GLM)分析, m59標(biāo)記在湛江群體中與殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重關(guān)聯(lián)顯著(P<0.05)(表2),其中GT基因型的殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重顯著高于GG 基因型的個(gè)體, 分別高出 8.9%、5.63%、8.09%和21.38%(表3); 在湛江群體中進(jìn)行驗(yàn)證也得到類似的結(jié)果, 該位點(diǎn)與殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重4個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)關(guān)聯(lián)顯著(P<0.05)(表2), 其GT基因型的個(gè)體的殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重比 GG基因型個(gè)體分別高出10.95%、11.41%、11.90%和26.67%(表3)。

154165位點(diǎn)在湛江群體中與殼高關(guān)聯(lián)顯著(P<0.05)(表2), GG、AG基因型的個(gè)體殼高均值顯著高于基因型為 AA的個(gè)體, 分別高出 9.24%和5.87%(表 3); 而在深圳群體中與殼高關(guān)聯(lián)不顯著(P>0.05), 卻與殼寬關(guān)聯(lián)顯著(P<0.05)(表2), GG基因型的個(gè)體殼寬均值顯著高于AG和AA基因型的個(gè)體, 分別比 AG和 AA基因型個(gè)體高 17.14%和18.06% (表 3)。

2.2 QTL連鎖標(biāo)記SNP二倍型構(gòu)建及生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

為了進(jìn)一步研究這兩個(gè)QTL連鎖標(biāo)記SNP與生長(zhǎng)性狀的整體作用, 基于這兩個(gè)QTL在這2個(gè)群體分別構(gòu)建二倍型。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 在湛江群體中, 雖然二倍型C1型(AAGT)和C2型(GGTT)在殼高、殼長(zhǎng)和總重顯著高于C5型(AAGG), 但由于二倍型C2在殼寬與二倍型C5沒有顯著性差異, 因此二倍型C1對(duì)馬氏珠母貝的生長(zhǎng)最為有利(表 4); 在深圳群體中, 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)這5種二倍型與馬氏珠母貝的殼高、殼長(zhǎng)、殼寬、總重關(guān)聯(lián)顯著(P<0.05), 二倍型為 D1(AGGT)和D2(AAGT)型的馬氏珠母貝在4個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)顯著高于D4(AAGG)和 D5(GGTT)型(P<0.05), 二倍型 D1(AGGT)和D2(AAGT)的 4個(gè)生長(zhǎng)性狀沒有顯著差異(P>0.05), 且個(gè)體最大, 可作為優(yōu)選的基因型組合(表4)。

表2 馬氏珠母貝QTL連鎖標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的GLM分析Tab.2 Association analysis of QTL and growth traits in Pinctada martensii using GLM

表3 馬氏珠母貝2個(gè)QTL位點(diǎn)不同基因型多重比較Tab.3 Multiple comparison of growth traits in Pinctada martensii at two QTL loci

表4 QTL連鎖標(biāo)記SNP二倍型與馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Associations between diplotypes of QTL and growth traits in Pinctada martensii

3 討論

目前, 雖然開展了遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物多達(dá)幾十種, 但是將 QTL結(jié)果應(yīng)用于遺傳改良中的研究還是較少[19], 比較典型的成功例子是牙鲆抗病淋巴囊腫病(LD)、大西洋鮭魚抗傳染病胰腺壞死病(IPN)的輔助選育中[12,14]。相對(duì)于抗病相關(guān)的 QTL結(jié)果, 生長(zhǎng)性狀更容易受到環(huán)境因素的影響, 具有數(shù)量性狀的遺傳特征, 在一個(gè)群體或者家系中定位到的QTL可能不適用于另一個(gè)家系或者群體。因此如何驗(yàn)證這些 QTL, 進(jìn)而利用與性狀緊密連鎖的QTL標(biāo)記進(jìn)行性狀的遺傳改良將是下一個(gè)階段的研究重點(diǎn)。

研究表明, 用不同遺傳背景、不同發(fā)育階段以及不同養(yǎng)殖環(huán)境的群體或者家系獲得的QTL間存在共享 QTL和特異 QTL。Rexroad等[20]在虹鱒 Omy16連鎖群上定位到1個(gè)皮質(zhì)醇濃度連鎖的極顯著QTL區(qū)間, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)與 3個(gè)虹鱒家系的皮質(zhì)醇濃度具有相關(guān)性, 而與另外 4個(gè)家系的皮質(zhì)醇濃度不相關(guān);Laghari等[21]定位到與鯉魚3個(gè)不同階段體重相關(guān)的QTL, 在第6連鎖群上的1個(gè)QTL與3個(gè)階段的體重都相關(guān)的 QTL, 而不同階段也有特異的 QTL存在。Wang等[5]在2個(gè)不同遺傳背景的群體中對(duì)生長(zhǎng)性狀QTL進(jìn)行驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)連鎖群LG2上的QTL標(biāo)記 Lca371在 2個(gè)群體中與體重具有顯著的相關(guān)性,而其他QTL僅在一個(gè)家系表現(xiàn)出與性狀的相關(guān)性。本文使用 2個(gè)不同遺傳背景的馬氏珠母貝群體對(duì)154165和m59標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)m59標(biāo)記在這2個(gè)群體中為共享QTL, 且該位點(diǎn)的GT基因型個(gè)體的生長(zhǎng)性狀(殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重)顯著高于GG基因型的個(gè)體, 為馬氏珠母貝生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)基因型, 而154165標(biāo)記為特異 QTL, 即在湛江群體中與殼高相關(guān)性顯著, 在深圳群體中與殼寬相關(guān)性顯著。這一結(jié)果與 Wang等[5]驗(yàn)證尖吻鱸的 QTL結(jié)果類似。這 2個(gè)QTL的效應(yīng)大小在2個(gè)群體中不一樣的原因可能是不同遺傳背景下QTL的等位基因頻率不相同。出現(xiàn)這些特異的 QTL 的原因可能是生長(zhǎng)性狀受到QTL間的上位性效應(yīng)的影響[22]以及QTL和環(huán)境互作的影響。在雞的下頜骨研究中也發(fā)現(xiàn)QTL間的上位性互作效應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)性狀的表型值具有重要的作用[23]。

Shi等[17]在 6個(gè)生長(zhǎng)性狀中定位到的 m59只與珍珠層厚度相關(guān), Li等[18]定位到的QTL154165與總重和殼重相關(guān), 雖然有一些性狀指標(biāo)在本研究中沒有檢測(cè), 但在本研究中顯著關(guān)聯(lián)的性狀仍與這兩篇文獻(xiàn)的報(bào)道存在一定的差異。造成這種差異的原因可能是: 定位到的這些 QTL一般是通過特定家系作圖獲得, 獲得的 QTL結(jié)果可能不適合用于另一個(gè)家系或者群體; QTL作圖時(shí)在LOD臨界值下錯(cuò)誤的判斷有 QTL存在而出現(xiàn)假陽性; 表型分型不夠準(zhǔn)確也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)誤差。孫效文等建議將QTL結(jié)果應(yīng)用育種之前最好在大樣本量的隨機(jī)群體中進(jìn)行驗(yàn)證, 以增加QTL在育種群體中的利用價(jià)值[24,25]。本文利用2個(gè)不同遺傳背景的群體對(duì)通過遺傳圖譜獲得的馬氏珠母貝生長(zhǎng)性狀QTL進(jìn)行驗(yàn)證, 對(duì)實(shí)施MAS有著重要的意義。

單獨(dú)的SNP標(biāo)記進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析提供的信息往往是有限的, 通過構(gòu)建二倍型可以提供更豐富的遺傳信息來彌補(bǔ)單獨(dú) SNP 的缺陷[26-28]。García- Magari?os 等[29]發(fā)現(xiàn)人類一些復(fù)雜疾病可能與SNP-SNP相互作用有關(guān); 在鯉魚IGF-I基因中的單個(gè) SNP位點(diǎn) g.7722T>C與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)不顯著(P>0.05), 但是當(dāng)SNP g.7627T>A和g.7722T>C結(jié)合時(shí), 發(fā)現(xiàn)二倍型(TTTT)個(gè)體的體重、體長(zhǎng)和 K值均顯著小于其他二倍型(P<0.01)[30]; Cong等[31]研究長(zhǎng)牡蠣I(yíng)RR基因上的2個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建的5個(gè)二倍型中, 發(fā)現(xiàn)二倍型D3(GGTT)是對(duì)長(zhǎng)牡蠣的生長(zhǎng)最為有利。在本研究中, 基于2個(gè)QTL連鎖標(biāo)記SNP分別在湛江和深圳群體中構(gòu)建二倍型, 發(fā)現(xiàn)二倍型(AAGT)在湛江和深圳群體中對(duì)馬氏珠母貝的生長(zhǎng)最為有利的基因型組合。這一結(jié)果表明m59位點(diǎn)的GT基因及與其他位點(diǎn)基因型結(jié)合可能有利于馬氏珠母貝的生長(zhǎng)。此外, 在深圳群體中二倍型D1(AGGT)也是對(duì)馬氏珠母貝生長(zhǎng)最為有利的二倍型之一, 而在湛江群體中沒有出現(xiàn)此二倍型類型的個(gè)體, 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能有用驗(yàn)證的兩個(gè)群體的數(shù)量大小有差異, 從而引起等位基因頻率在不同的群體中不一樣, 基因型組合的類型也不一樣;群體間存在特異QTL也是原因之一。

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