趙曼曼 , 姜敬哲 何 健 孫永嬋 , 王江勇

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510300; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 3. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524025)

雜色鮑(Haliotis diversicolor)是我國(guó)南方貝類水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要品種之一, 具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。長(zhǎng)期以來(lái), 雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)一直是我國(guó)南海區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)。但近年來(lái), 鮑病頻發(fā)[1-2], 引起了從事貝類病害的專家與學(xué)者的廣泛關(guān)注, 如在1999至2000 年, 福建、廣東等地多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)鮑魚(yú)相繼暴發(fā)病毒性疾病, 造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。此外,細(xì)菌性疾病也一直是影響鮑養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素,如已報(bào)道過(guò)的危害皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus hannai)養(yǎng)殖業(yè)的膿皰病[3]和雜色鮑肌肉萎縮癥[4]等均為細(xì)菌性疾病。國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在鮑病的病原分離與鑒定方面, Otsu等[5]利用電鏡觀察到患病盤(pán)鮑神經(jīng)干附近的細(xì)胞質(zhì)中存在類病毒粒子。Nakatsug等[6]從患病盤(pán)鮑初級(jí)培養(yǎng)的血細(xì)胞中分離到與反轉(zhuǎn)錄病毒形狀和大小類似的病毒粒子。李霞等[7]在患“裂殼病”的皺紋盤(pán)鮑中發(fā)現(xiàn)一種球狀病毒, 王江勇等[8]報(bào)道了雜色鮑中有類似但個(gè)體較大的病毒。張晗等[9]研究了血藍(lán)蛋白(Hemocyanin, Hc)在雜色鮑各組織中的分布, 而關(guān)于雜色鮑血藍(lán)蛋白基因?qū)Σ≡碳さ捻憫?yīng)方面、機(jī)體被病原刺激后免疫相關(guān)因子的變化以及刺激后的血淋巴抑菌性等方面的研究較少。本文主要研究哈維弧菌(Vibrio harveyi)、鮑類皰疹病毒(Abalone herpesvirus, AbHV)懸液注射雜色鮑后血漿中可溶性總蛋白濃度的變化, 免疫因子超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)活性的變化, 雜色鮑外套膜、鰓、肝胰腺、腹足中血藍(lán)蛋白基因Hc1、Hc2相對(duì)表達(dá)量的變化以及注射后對(duì)雜色鮑無(wú)細(xì)胞血漿的抑菌性的影響, 以期為雜色鮑病害的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采自深圳市東山某鮑魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的健康雜色鮑,殼長(zhǎng)4～6 cm, 殼寬為3～4 cm, 體質(zhì)量為20～24 g。雜色鮑采回后, 置于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 菌種和病毒

哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶珊瑚弧菌菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存, 鮑類皰疹病毒提取自實(shí)驗(yàn)室–80℃保存的病鮑病料。

1.1.3 試劑

ACP、AKP及SOD測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AbHV病毒懸液的制備

AbHV病毒懸液的制備根據(jù)張濤等[10]病毒注射液制備的方法進(jìn)行改進(jìn), 常規(guī)解剖病鮑, 取內(nèi)臟軟組織部分, 液氮研磨, 反復(fù)凍融 3次, 用預(yù)冷的 SB緩沖液以1∶10的比例, 制成勻漿液, 依次離心:1 000 r/min, 5 min, 取上清; 3 000 r/min, 5 min, 取上清; 5 000 r/min, 5 min, 取上清; 8 000 r/min, 5 min,取上清; 10 000 r/min, 5 min, 取上清; 12 000 r/min, 5 min,取上清; 12 000 r/min, 10 min, 取上清。以28%蔗糖墊為底, 小心加入上述離心后的上清液, 60 000 r/min,120 min; 離心結(jié)束, 用1×PBS溶液溶解沉淀, 然后用0.45 μm濾膜過(guò)濾, 濾液為病毒懸液, 取50 μL病毒懸液提取AbHV的DNA, 絕對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)AbHV含量為107copies/ng。

1.2.2 哈維弧菌菌懸液的制備

實(shí)驗(yàn)室–80℃保存的哈維弧菌菌種(分離自弧菌病的病鮑), 用 LB固體培養(yǎng)基平板(含 2%的 NaCl,下同)活化培養(yǎng) 18 h, 挑取單菌落接到 LB斜面上培養(yǎng)18 h, 用無(wú)菌1×PBS清洗, 經(jīng)比濁法計(jì)數(shù), 調(diào)整密度至5 ×107CFU/ mL, 此為菌懸液。

1.2.3 人工注射

健康雜色鮑共 120只, 分為 A、B、C三組, 每組40只, A組注射哈維弧菌菌懸液, B組注射AbHV病毒懸液, C組注射1×PBS(對(duì)照組), 以微量注射器注射腹足, 注射劑量為100 μL /只。3組鮑分別飼養(yǎng)于具循環(huán)過(guò)濾水裝置的玻璃缸內(nèi), 晝夜不間斷充氣,水溫控制在22℃。

1.2.4 無(wú)細(xì)胞血淋巴的制備與各組織總RNA提取

在注射之前隨機(jī)選取共5只健康雜色鮑作為0 h空白組, 然后分別在注射后3, 6, 12, 24 , 48, 72 h, 每組取5只鮑, 用腹足創(chuàng)傷法分別收集血淋巴于1.5 mL無(wú)菌管中。血淋巴以5 000 r/min、4℃離心10 min, 去沉淀, 上層血清保存于–80℃冰箱中備用。注射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取雜色鮑的外套膜、鰓、肝胰臟以及腹足各約50 mg分別置于2 mL無(wú)菌Eppondorf管中, 用TRAzol法提取組織RNA, 測(cè)定RNA濃度及純度, –80℃保存。

1.2.5 cDNA制備

以雜色鮑各組織總 RNA為模板, 按照 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 合成cDNA, –80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 qPCR引物設(shè)計(jì)及引物特異性檢測(cè)

根據(jù)課題組克隆的雜色鮑血藍(lán)蛋白 Hc1、Hc2全基因序列(數(shù)據(jù)未發(fā)表), 在 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 網(wǎng)站上, 分別在線設(shè)計(jì)血藍(lán)蛋白基因特異的引物各2對(duì)及內(nèi)參基因核糖體L5蛋白基因引物(L5F366/L5R653: GTCGGGCTGACCA ACTAT/ GAGTCAAAGCCTGGGAAC), 引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。以腹足、鰓組織的cDNA為模板, 進(jìn)行普通 PCR, 檢測(cè)引物的特異性,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 選取Hc1F1/Hc1R1(Hc1F/R:ACCTTGGTGCGGACTTGATT/TTCAGGAGTCAAG CTGTCGG)和Hc2F1/Hc2R1(Hc2F/R: ACTGATAGC ACCAACCTTCCG/GCAGTCTCCCTGGTTGTCAG)對(duì)各組織cDNA 進(jìn)行qPCR檢測(cè)。選用核糖體L5 蛋白基因作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。

1.2.7 無(wú)細(xì)胞血淋巴免疫酶活性的測(cè)定

(1) 蛋白濃度的測(cè)定

參考 Bradford法, 改進(jìn)蛋白測(cè)定試劑盒的測(cè)定方法, 以適用微量血淋巴和多樣本的測(cè)定。該方法用96微孔板于620 nm 處測(cè)定產(chǎn)物的吸光度。

(2) 酶活性的測(cè)定

ACP 活性定義為: 100 mL 血清在 37℃條件下與基質(zhì)作用30 min 產(chǎn)生1 mg 酚為1 個(gè)金氏單位;AKP活性定義為: 100 mL 血清在37℃條件下與基質(zhì)作用15 min 產(chǎn)生1 mg 酚為1 個(gè)金氏單位。SOD 活性參照黃嘌呤氧化酶法測(cè)定, 定義為: 每毫升反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50.0%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U)。以上酶活力具體測(cè)定方法參照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.8 抑菌性測(cè)定

采用液體培養(yǎng)基微量稀釋評(píng)估法: 參照 du Toit等[11]方法, 進(jìn)行稍微改進(jìn): 在1.5 mL 無(wú)菌Eppondorf管中, 加 650 μL LB液體培養(yǎng)基然后每管再加100 μL稀釋好的菌懸液, 加入250 μL無(wú)細(xì)胞血漿后輕微振蕩使之混勻, 空白組為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基, 以不加入無(wú)細(xì)胞血漿為對(duì)照組, 在 28℃ 培養(yǎng) 12 h后, 每個(gè)樣吸取200 μL加入無(wú)菌的96孔板中, 用酶標(biāo)儀檢測(cè)在600 nm 波長(zhǎng)下的OD(Optical density, OD)值, 通過(guò)OD值的大小表示抑菌能力的強(qiáng)弱。抑菌率按照以下公式計(jì)算: R＝[1－(As－A0)/(Az－A0)]×100%, 其中As為實(shí)驗(yàn)組OD值, Az為對(duì)照組OD值, A0為空白組OD值。

1.2.9 qPCR法檢測(cè)基因表達(dá)差異

qPCR每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3個(gè)重復(fù)。采用相對(duì)定量CT法(2–ΔΔCTmethod)分析數(shù)據(jù), 本實(shí)驗(yàn)采用以注射PBS對(duì)照組的雜色鮑的相應(yīng)各組織及各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)量作為 ΔCT校正樣, 取 5只鮑相同組織2–ΔΔCT平均值作圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行, 數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示, 組間差異采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較, 檢驗(yàn)處理間的差異顯著性(P<0.05),并用Excel 2010作出實(shí)驗(yàn)柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射哈維弧菌和 AbHV后雜色鮑血淋巴中可溶性總蛋白濃度的變化

注射組及對(duì)照組的雜色鮑無(wú)細(xì)胞血漿的蛋白濃度變化見(jiàn)圖1。哈維弧菌注射組在注射3 h與對(duì)照組相比稍有下降, 差異不顯著(P>0.05), 在注射第6小時(shí)和第12小時(shí)均上升, 注射6 h時(shí)達(dá)到最大值17.75 g/L, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 在第24小時(shí)之后開(kāi)始下降, 在注射72 h時(shí)無(wú)細(xì)胞血漿蛋白濃度下降到最低值 2.5 g/L, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05);AbHV注射組在注射6 h稍有下降, 與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05), 隨后開(kāi)始上升, 第12小時(shí)達(dá)到最大值14.84 g/L, 在注射第48小時(shí)時(shí)開(kāi)始下降, 在第48小時(shí)蛋白濃度達(dá)到最低值3.07 g/L。對(duì)照組在各個(gè)時(shí)相均無(wú)明顯變化(P>0.05)。對(duì)比哈維弧菌和AbHV注射組發(fā)現(xiàn), 在病原注射的3、6、24 h的3個(gè)時(shí)間點(diǎn), 雜色鮑無(wú)細(xì)胞血漿的蛋白濃度變化差異顯著(P<0.05)。

圖1 注射哈維弧菌和AbHV后雜色鮑血淋巴中可溶性總蛋白濃度的變化Fig.1 Changes of the total protein concentration in the hemolymph after injection of V. harveyi and abalone herpesvirus

2.2 雜色鮑血淋巴中酶活性的變化

2.2.1 雜色鮑血淋巴中ACP活性的變化

哈維弧菌注射組和AbHV注射組的ACP活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(圖 2a), 哈維弧菌注射組的ACP活性在48 h達(dá)到最大值3.41金氏單位/100mL,在48 h之后開(kāi)始下降到1.17金氏單位/100mL, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05); AbHV注射組ACP活性在前48 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 在12 h達(dá)到最大值4.86金氏單位/100mL, 與對(duì)照組差異顯著(P<0.05), 48 h之后開(kāi)始下降。對(duì)比哈維弧菌和AbHV注射組發(fā)現(xiàn), 從注射的第 6小時(shí)開(kāi)始, 隨后注射的各個(gè)時(shí)相血淋巴中的ACP活性均差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 雜色鮑血淋巴中AKP活性的變化

哈維弧菌注射組的AKP活性在注射后第3小時(shí)稍有下降(圖 2b), 與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05), 在第 6小時(shí)至第 48小時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 在第 48小時(shí)AKP的活性上升到最高值2.73金氏單位/100mL, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 隨后 AKP的活性開(kāi)始下降, 在第72小時(shí)下降到0.51金氏單位/100mL。AbHV注射組的AKP活性在注射后的第3小時(shí)下降, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 在第6小時(shí)和第12小時(shí)AKP活性均升高, 其中在第12小時(shí)AKP活性達(dá)到最高值 2.91金氏單位/100mL, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 在第24小時(shí)之后開(kāi)始下降, 在第72小時(shí)下降到0.50金氏單位/100mL。哈維弧菌和AbHV注射組在注射后的第3小時(shí), 第12小時(shí), 第48小時(shí)的AKP活性均差異顯著(P<0.05)。

圖2 注射哈維弧菌和AbHV后雜色鮑無(wú)細(xì)胞血淋巴中酶活性的變化Fig.2 Changes of ACP, AKP, and SOD activity in the hemolymph without cells after injection of V. harveyi and abalone herpesvirus

2.2.3 雜色鮑血淋巴中SOD活性的變化

哈維弧菌注射組的 SOD的活性在注射后的第3小時(shí)稍有下降(圖2c), 與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05), 在第 6小時(shí)和第 12小時(shí)均上升, 其中在第 6小時(shí)達(dá)到最高值1 459.76 U/mL, 與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 在第24小時(shí)之后開(kāi)始下降。AbHV注射組的SOD活性與對(duì)照組相比在注射后的各個(gè)時(shí)相均呈下降趨勢(shì), 其中從注射后第 6小時(shí)起的各個(gè)時(shí)相的 SOD活性與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)。對(duì)比哈維弧菌注射組和AbHV注射組的SOD活性變化發(fā)現(xiàn), 在注射后的第6小時(shí), 12小時(shí), 48小時(shí), 72小時(shí)均差異顯著。

2.3 血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化

2.3.1 注射哈維弧菌后雜色鮑各組織中血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化

注射哈維弧菌后雜色鮑外套膜中血藍(lán)蛋白基因Hc1、Hc2相對(duì)表達(dá)量變化見(jiàn)圖3a, Hc1的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低再升高, 第6小時(shí)升高1.43倍, 在9 h開(kāi)始降低, 到第12小時(shí)降低到0.11倍, 在第72小時(shí)開(kāi)始升高; Hc2的相對(duì)表達(dá)量先降低后升高, 在3 h降低到0.25倍, 隨后在第6小時(shí)開(kāi)始升高, 在第12小時(shí)升高7.83倍。在鰓中(圖3b), Hc1的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低, 在第3小時(shí)升高6.68倍, 在第12小時(shí)開(kāi)始下降到0.27倍, 隨后均表現(xiàn)出下降趨勢(shì); Hc2的表達(dá)量在第3小時(shí)降低到0.19倍, 第6小時(shí)升高4.21倍, 在12 h和72 h均升高, 其他時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為下降。在肝胰腺中(圖3c), Hc1的相對(duì)表達(dá)量先降低后升高, 在第9小時(shí)降低到0.25倍, 隨后開(kāi)始升高, 至第72小時(shí)相對(duì)表達(dá)量升高17.36倍; Hc2的相對(duì)表達(dá)量在12 h略有下降, 其他時(shí)間點(diǎn)均上升, 在第24小時(shí)升高60.29倍。在腹足中(圖3d), Hc1的相對(duì)表達(dá)量先上升后下降, 在第6小時(shí)升高8.79倍, 在第24小時(shí)和48 h開(kāi)始下降到0.4倍, 在第72小時(shí)又升高到注射前水平; Hc2的相對(duì)表達(dá)量先降低后升高, 在第12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)升高, 其中第24小時(shí)升高31.89倍, 在第72小時(shí)開(kāi)始降低到0.22倍。

2.3.2 注射AbHV后雜色鮑各組織中血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化

圖3 注射哈維弧菌后雜色鮑各組織中血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.3 The relative expression levels of hemocyanin gene in different tissues of H. diversicolor after injection of V. harveyi

圖4 注射AbHV后雜色鮑各組織中血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.4 The relative expression levels of hemocyanin gene in different tissues of H. diversicolor after injection of abalone herpesvirus

雜色鮑外套膜中血藍(lán)蛋白基因Hc1、Hc2相對(duì)表達(dá)量變化見(jiàn)圖4a, Hc1的相對(duì)表達(dá)量先降低后升高再降低, 第 24小時(shí)升高 2.26倍, 而在其他各時(shí)間點(diǎn)Hc1的相對(duì)表達(dá)量均降低; Hc2的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低再升高, 在6 h升高6.49倍, 隨后在第9小時(shí)開(kāi)始降低, 在第48小時(shí)后開(kāi)始升高, 在第72小時(shí)表達(dá)量與對(duì)照組相當(dāng)。在鰓中(圖4b), Hc1在第3小時(shí)降低, 在第6小時(shí)升高到與對(duì)照組表達(dá)水平相當(dāng), 至第9小時(shí)開(kāi)始降低, 在12 h升高至與對(duì)照組表達(dá)水平相當(dāng), 隨后開(kāi)始降低; Hc2的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低再升高, 在第6小時(shí)升高5.08倍, 隨后開(kāi)始降低,到第24小時(shí)開(kāi)始升高。在肝胰腺中(圖4c), Hc1的相對(duì)表達(dá)量先降低后升高, 在第 24小時(shí)開(kāi)始升高, 至第72小時(shí)相對(duì)表達(dá)量升高9.03倍; Hc2的相對(duì)表達(dá)量先降低后升高再降低最后升高, 在第24小時(shí)升高6.4倍。在腹足中(圖4d), Hc1的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低, 在第6小時(shí)升高20.95倍, 在第48小時(shí)開(kāi)始下降; Hc2的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低, 在第3小時(shí)升高10.63倍, 在第72小時(shí)開(kāi)始降低到0.74倍。

2.4 注射哈維弧菌和 AbHV后雜色鮑無(wú)細(xì)胞血淋巴的抑菌性

2.4.1 對(duì)哈維弧菌的抑菌性

注射哈維弧菌后的雜色鮑無(wú)細(xì)胞血漿的抑菌率與對(duì)照組抑菌率相比明顯升高(圖5a), 從注射后的6 h起, 血淋巴的抑菌率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),并在48 h抑菌率達(dá)到了最大值20.20%, 隨后抑菌率開(kāi)始下降, 但仍比對(duì)照組的抑菌率高且差異顯著(P<0.05)。注射AbHV后血淋巴對(duì)哈維弧菌的抑菌率與對(duì)照組相比同樣升高, 從注射后的 12 h起, 抑菌率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 并在24 h抑菌率達(dá)到了最大值 19.57%, 隨后抑菌率開(kāi)始下降, 但仍比對(duì)照組的抑菌率高且差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抑菌性

注射哈維弧菌后血漿對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抑菌率與對(duì)照組相比明顯升高, 從注射后的第6小時(shí)起, 無(wú)細(xì)胞血淋巴的抑菌率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 并在48 h抑菌率達(dá)到了最大值41.43%, 隨后抑菌率開(kāi)始下降, 但仍高于對(duì)照組的抑菌率且差異顯著(P<0.05)(圖5b)。注射AbHV后血漿對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抑菌率與對(duì)照組相比同樣升高, 從注射后的第 3小時(shí)起, 抑菌率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 并在48 h抑菌率達(dá)到了最大值 43.84%, 隨后開(kāi)始下降,仍比對(duì)照組高但差異不顯著(P>0.05)。

2.4.3 對(duì)溶珊瑚弧菌的抑菌性

哈維弧菌注射后血漿對(duì)溶珊瑚弧菌的抑菌率與對(duì)照組相比明顯升高, 從注射后的3 h起, 抑菌率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 并在24 h抑菌率達(dá)到了最大值 48.93%, 隨后開(kāi)始下降, 但仍高于對(duì)照組的抑菌率且差異顯著(P<0.05)(圖 5c)。AbHV 注射后血漿對(duì)溶珊瑚弧菌的抑菌率明顯高于對(duì)照組, 注射后的第3小時(shí)起, 抑菌率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05), 并在48 h抑菌率達(dá)到了最大值47.11%, 隨后開(kāi)始下降, 仍比對(duì)照組高且差異顯著(P<0.05)。

圖5 哈維弧菌和AbHV注射后雜色鮑無(wú)細(xì)胞血淋巴對(duì)哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶珊瑚弧菌的抑菌性Fig.5 The anti-bacterial ability of the hemolymph in abalone (H. diversicolor) against V. harveyi, V. vulnificus and V. coralliiluyitcus after injected with V.harveyi and abalone herpesvirus

綜上所述, 注射哈維弧菌和 AbHV后雜色鮑免疫相關(guān)因子發(fā)生明顯的變化, 其中血淋巴中可溶性總蛋白濃度升高; ACP和AKP活性均在病原注射后的不同時(shí)間點(diǎn)升高, 哈維弧菌注射組的SOD活性升高, 而AbHV注射組的SOD活性下降; 雜色鮑血藍(lán)蛋白基因Hc1、Hc2相對(duì)表達(dá)量分別在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)上升。

3 討論

3.1 注射哈維弧菌和 AbHV后對(duì)雜色鮑血淋巴的影響

Yoganandhan等[12]在注射對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的印度明對(duì)蝦(Fenneropenaeus indicus)中檢測(cè)到血清蛋白濃度高于正常蝦。黃旭雄等[13]研究了哈維弧菌急性注射和WSSV急性暴發(fā)后中國(guó)明對(duì)蝦 (Fenneropenaeus chinensis)非特異性免疫水平的變化發(fā)現(xiàn), 血清蛋白濃度極顯著升高, 這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)中, 注射哈維弧菌和 AbHV后的雜色鮑的血淋巴中可溶性總蛋白濃度顯著升高。

在缺乏特異性免疫球蛋白的軟體動(dòng)物體內(nèi), 吞噬作用成為其免疫防御的一種主要方式, ACP和AKP是吞噬溶酶體的重要組成部分, 在細(xì)胞進(jìn)行吞噬和包囊反應(yīng)中, 會(huì)伴隨有ACP的釋放[14]。在酸性環(huán)境下, ACP能夠通過(guò)水解作用將表面帶有磷酸酯的異物破壞掉, 從而達(dá)到預(yù)防注射的目的, 并可修飾或改變外來(lái)異物的表面分子組成, 從而增強(qiáng)血細(xì)胞對(duì)異物的識(shí)別, 起到調(diào)理的作用, 加快吞噬細(xì)胞對(duì)異物的吞噬和降解速度[15]。AKP存在于軟體動(dòng)物中的肝臟、血細(xì)胞和血清中, 同 ACP一樣也作為軟體動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分, 在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[16]。牟海津等[16]用免疫多糖對(duì)櫛孔扇貝(Chlamys farrei)進(jìn)行注射后, 血清中的ACP 活性、AKP 活性顯著提高, 王淑紅[17]和王江勇[18]分別用弧菌和病毒懸液注射雜色鮑后, 其血淋巴的ACP 活性和AKP 活性均在不同的時(shí)間點(diǎn)顯著升高。在本實(shí)驗(yàn)中, 哈維弧菌注射組和 AbHV注射組的雜色鮑血漿中的ACP和AKP活性在不同時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出升高現(xiàn)象。其中, 哈維弧菌注射組在注射后的第8小時(shí)血淋巴中的ACP活性達(dá)到最大值, AKP活性在第48小時(shí)達(dá)到最大值; 在 AbHV注射組中, 血漿中的 ACP和AKP活性均在第12小時(shí)達(dá)到最大值, 這說(shuō)明哈維弧菌和AbHV 對(duì)ACP和AKP的活性都有一定程度的誘導(dǎo)作用, 激發(fā)了鮑的免疫反應(yīng)。

SOD是廣泛存在于生物體中的重要的抗氧化酶。SOD能作為活性氧清除劑參與清除體內(nèi)自由基O2–和H2O2, 以消除O2–等的中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害,能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和機(jī)體的免疫功能,在抗輻射損傷、防機(jī)體衰老和抗腫瘤等方面具有極為重要的作用[19]。丁秀云等[20]對(duì)皺紋盤(pán)鮑血淋巴中的SOD 活力進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)皺紋盤(pán)鮑在注射細(xì)菌后,SOD 活力降低, 王淑紅等[17]利用弧菌注射雜色鮑也發(fā)現(xiàn)SOD 活性顯著降低。這與本實(shí)驗(yàn)中的AbHV注射組的SOD活性降低的結(jié)果一致。牟海津等[16]用免疫多糖對(duì)櫛孔扇貝進(jìn)行注射后, 其血清中的SOD 活性顯著提高。王江勇等[18]用病毒懸液注射雜色鮑,在第8小時(shí)時(shí)SOD 活性最高。在本實(shí)驗(yàn)中, 哈維弧菌注射組的過(guò)氧化物歧化酶SOD的活性在注射后的第3小時(shí)稍有下降, 在第6小時(shí)和第12小時(shí)均上升,其中在第6小時(shí)達(dá)到最高值1 459.76 U/mL, 在第24小時(shí)之后開(kāi)始下降。在正常情況下, SOD 清除活性氧自由基, 保護(hù)機(jī)體免受自由基傷害, 當(dāng)注射細(xì)菌后, 在細(xì)菌的作用下產(chǎn)生大量的自由基, SOD 酶活性也在自由基的誘導(dǎo)下隨之升高, 以清除過(guò)量的自由基, 因此在注射后出現(xiàn)了酶活性升高的現(xiàn)象[18]。

3.2 血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的變化分析

血藍(lán)蛋白是節(jié)肢、軟體動(dòng)物中的一種多功能蛋白, 具有氧氣運(yùn)輸?shù)榷喾N功能。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),血藍(lán)蛋白還具有抗病毒和抗菌活性, 如有研究表明,在日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)注射WSSV后, 血藍(lán)蛋白基因被大量誘導(dǎo)表達(dá), 參與對(duì)蝦的抗病毒感染過(guò)程[21]。有學(xué)者應(yīng)用親和層析技術(shù)在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)血淋巴中純化出兩種血藍(lán)蛋白亞基, 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn), 這兩種血藍(lán)蛋白的亞基能對(duì)多種病毒的復(fù)制產(chǎn)生一定的抑制作用[22]。在健康的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)和淡水鰲蝦(Pacifastacus leniusculus)的血淋巴中, 純化出不同的血藍(lán)蛋白 C 末端降解出來(lái)的抗菌肽段, 這些肽段都對(duì)一些細(xì)菌產(chǎn)生了良好的抑制作用[23-24], 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn), 此抗菌肽的表達(dá)可被葡聚糖或脂多糖誘導(dǎo)[25], 這說(shuō)明其可被細(xì)菌感染誘導(dǎo)表達(dá)。莊軍等[26]預(yù)測(cè)了軟體動(dòng)物Haliotis tuberculata血藍(lán)蛋白的抗菌肽。在本實(shí)驗(yàn)中, 注射哈維弧菌和AbHV后, 雜色鮑外套膜、鰓、肝胰腺以及腹足中血藍(lán)蛋白兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)升高,說(shuō)明有可能是注射病原誘導(dǎo)了雜色鮑血藍(lán)蛋白的表達(dá), 從而出現(xiàn)血藍(lán)蛋白相對(duì)表達(dá)量升高的現(xiàn)象。

3.3 血淋巴的抑菌性分析

對(duì)一些節(jié)肢和軟體動(dòng)物的研究證實(shí)自然狀態(tài)或經(jīng)細(xì)菌注射后其血漿和血淋巴中都存在抑菌活性物質(zhì)[27-29]。王雷[30], 李春猛[31], 雷質(zhì)文[32]報(bào)道了中國(guó)明對(duì)蝦血淋巴的抗菌能力。Alabi等報(bào)道凡納濱對(duì)蝦在注射細(xì)菌后血淋巴抑菌能力明顯增強(qiáng)[33]。此外, 背角無(wú)齒蚌(Anodonta woodiana)血淋巴對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)等12種細(xì)菌的生長(zhǎng)具不同程度的抑制作用[34]。目前在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的各種抗菌因子已經(jīng)達(dá)到幾百種, 許多研究證實(shí)抗菌因子的表達(dá)是可以誘導(dǎo)的[35], 本研究表明, 病原注射后的雜色鮑的血淋巴對(duì)3種貝類病原均表現(xiàn)出了不同程度的抑菌性(圖 5), 且與對(duì)照組相比抑菌性明顯增強(qiáng), 推測(cè)注射哈維弧菌和 AbHV后誘導(dǎo)了雜色鮑體內(nèi)儲(chǔ)存的抗菌因子的釋放或新的抗菌因子合成, 詳細(xì)機(jī)制有待于深入研究。

貝類的體液免疫主要是依靠血清中的一些非特異性的酶或因子來(lái)進(jìn)行的, 在受到外界刺激后, 作為免疫活性因子被釋放到血清中, 代表著機(jī)體對(duì)抗入侵生物的一種體液防御機(jī)制。已有的研究表明, 在軟體動(dòng)物受到病原等異物刺激時(shí), 體內(nèi)與免疫活動(dòng)相關(guān)的酶活性會(huì)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生顯著的變化, 包括溶菌酶(Lysozyme, LZM)、ACP、AKP等溶酶體酶。這些酶活性的升高主要是由于血細(xì)胞會(huì)在外源刺激下, 迅速合成這些酶類, 并將其釋放到血清中, 參與免疫反應(yīng)[15]。溶酶體酶可以誘導(dǎo)產(chǎn)生, 具有與脊椎動(dòng)物獲得性體液免疫相似的作用[36]。因此, 注射哈維弧菌和 AbHV后, 雜色鮑受到刺激, 血淋巴中的可溶性總蛋白濃度升高, ACP和AKP活性升高, 而哈維弧菌注射組的血淋巴的SOD活性升高, AbHV注射組的SOD活性卻降低, 這可能是雜色鮑對(duì)細(xì)菌和病毒刺激的響應(yīng)機(jī)制不同。具有抗菌和抗病毒活性[21-24]的血藍(lán)蛋白在雜色鮑受到外界刺激時(shí), 其相對(duì)表達(dá)量提高。血淋巴中免疫相關(guān)酶活性的增加使得血淋巴對(duì)創(chuàng)傷弧菌、溶珊瑚弧菌等病原菌的抑菌能力增強(qiáng)。

本文針對(duì)雜色鮑在細(xì)菌和病毒刺激后一些免疫因子的變化進(jìn)行了初步研究, 為今后進(jìn)一步研究雜色鮑的非特異性免疫以及在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用免疫技術(shù)防治病害提供參考。然而, 目前我們對(duì)貝類自然防御體系的認(rèn)識(shí)還是非常有限的, 對(duì)其抵御細(xì)菌和病毒感染的機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

[1] 宋振榮, 紀(jì)榮興, 顏素芬, 等. 引起九孔鮑大量死亡的一種球狀病毒[J] . 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2000, 24(5): 463-467.

[2] 張朝霞, 王軍, 張蕉南, 等. 東山九孔鮑細(xì)菌性疾病研究[J]. 臺(tái)灣海峽, 2001, 20(2): 193 - 201.

[3] 劉金屏, 聶麗蘋(píng), 李太武, 等. 皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus)膿皰病的研究[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 1995, 2(2):78-84.

[4] 王江勇, 孫秀秀, 王瑞旋, 等. 雜色鮑肌肉萎縮癥病原菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué),2010, 6(5): 21-26.

[5] Otsu R, Sasaki K. Virus-like particles detected from juvenile abalones (Nordotis discus discus) reared with an epizootic fatal wasting disease [J]. J Invertebr Pathol,1997, 70 (2): 167-168.

[6] Nakatsugawa T, Nagai T, Hiya K, et al. A virus isolated from juvenile Japanese black abalone Nordotis discus discus affected with amyotrophia [J]. Dis Aquat Organ,1999, 36(2): 159-161.

[7] 李霞, 王斌, 劉淑范, 等. 皺紋盤(pán)鮑“裂殼病”的病原及組織病理的研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1998, 22(1): 61 -66.

[8] 王江勇, 陳畢生, 馮娟, 等. 雜色鮑裂殼病球狀病毒的初步觀察[J]. 熱帶海洋, 2000, 19(4): 63-67.

[9] 張晗, 姜敬哲, 何健, 等. 血藍(lán)蛋白在雜色鮑各組織中的分布研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2014, 10(4): 34-38.

[10] 張濤, 黃建華, 溫為庚, 等. WSSV+斑節(jié)對(duì)蝦的血清免疫相關(guān)酶對(duì)人工感染 WSSV粗提液的反應(yīng)[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2013, 9(1): 35-42.

[11] Du Toit E A, Rautenbach M. Sensitive standardized micro-gel well diffusion assay for the determination of antimicrobial activity [J]. J Microbiol Methods, 2000,42(2): 159-165.

[12] Yoganandhan K, Thirupathi S, Hameed A S S.Biochemical, physiological and hematological changes in white spot syndrome virus infected shrimp, Penaeus indicus [J]. Aquaculture, 2003, 221(2): 1-11.

[13] 黃旭雄, 周洪琪, 宋理平. 急性感染對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦非特異免疫水平的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(3):325-331.

[14] 翟玉梅, 丁秀云, 李光友.軟體動(dòng)物血細(xì)胞即體液免疫研究進(jìn)展[J].海洋與湖沼, 1998, 29(5): 558-561.

[15] Cheng T C. The role of lysosmal hydrolases in molluscan cellar response to immunologic challenge[J].Comp Pathbiol, 1978, 4: 59-71.

[16] 牟海津, 江曉路, 劉樹(shù)青, 等. 免疫多糖對(duì)櫛孔扇貝酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影響[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 29(3): 463-468.

[17] 王淑紅, 王藝?yán)? 張朝霞, 等. 弧菌和大腸桿菌注射對(duì)雜色鮑無(wú)細(xì)胞血淋巴中幾種酶活力的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004 , 11(1): 37-40 .

[18] 王江勇, 郭志勛, 馮娟, 等. 病毒感染后雜色鮑部分血清免疫因子的變化[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2005, 12(3):344-347.

[19] 劉志鴻, 牟海津, 王清印. 軟體動(dòng)物免疫相關(guān)酶研究進(jìn)展[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2003, 3(24): 86-90.

[20] 丁秀云, 李光友, 翟玉梅. 皺紋盤(pán)鮑經(jīng)誘導(dǎo)后血淋巴中一些因子變化的研究[J]. 海洋與湖沼, 1996, 27(4):362-367.

[21] Lei K Y, Lia F, Zhang M C, et al. Difference between hemocyanin subunits from shrimp Penaeus japonicus in anti-WSSV defense [J]. Dev Comp Immunol, 2008,32(7): 808-813.

[22] Zhang X B, Huang C H, Qin Q W. Antiviral properties of hemocyanin isolated from shrimp Penaeus monodon[J]. Antiviral Res, 2004, 61(2): 93-99.

[23] Destoumieux-Garzon D, Saulnier D, Garnier J, et al.Crustacean immunity : Antifungal peptides are generated from the C terminus of shrimp hemocyanin in response to microbial challenge [J]. J Biol Chem,2001, 276(50): 47070-47077.

[24] Lee S Y, Lee B L, Soderhall K. Processing of an antibacterial peptide from hemocyanin of the freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus [J]. J Biol Chem, 2003, 278(10): 7927-7933.

[25] 李義, 吳婷婷, 李紅霞. 甲殼動(dòng)物抗微生物肽研究進(jìn)展[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2006, 30(4) : 21-24.

[26] Zhuang Jun, Christopher J C, Zhu Hongtao, et al.Identification of candidate antimicrobial peptides derived from abalone hemocyanin [J]. Dev Comp Immunol, 2015, 49(1): 96-102.

[27] Haug T, Kjuul A K, Stensva K, et al. Antibacterial activity in four marine crustacean decapods [J]. Fish Shellfish Immunol, 2002, 12(5): 371-385.

[28] Schnapp D, Kemp G D, Smith V J. Purification and characterization of a proline-rich anti-bacterial peptide,with sequence similarity to bactenecin from the haemocytes of the shore crab, Carcinus maenas [J]. Eur J Biochem, 1996, 240(3): 532-539.

[29] Relf J M, Chisholm J R S, Kemp G D, et al.Purification and characterization of a cysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein from the granular haemocytes of the shore crab, Carcinus aenas [J]. Eur J Biochem, 1999, 264(2): 350-357.

[30] 王雷, 李光友, 毛遠(yuǎn)興. 中國(guó)對(duì)蝦血淋巴中的抗菌溶菌活力與酚氧化酶活力的測(cè)定及其特性研究[J]. 海洋與湖沼, 1995, 26(2): 179-185.

[31] 李春猛, 戰(zhàn)文斌, 馬甡, 等. 中國(guó)對(duì)蝦血淋巴抗菌活力的測(cè)定[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 29(4): 599-603.

[32] 雷質(zhì)文, 黃捷, 楊冰, 等. 96孔酶標(biāo)板法測(cè)定中國(guó)對(duì)蝦血淋巴上清液抗菌活力和酚氧化酶活性的初步研究[J]. 海洋湖沼通報(bào), 2001, 4: 33-37.

[33] Alabi A O, Latchford J W, Jones D A. Demonstration of residual antibacterial activity in plasma of vaccinated Penaeus vannamei [J]. Aquaculture, 187(1-2): 15-34.

[34] 朱越雄, 宋慧春. 背角無(wú)齒蚌血清的抑菌活性[J]. 水利漁業(yè), 2000, 20(6): 43-45.

[35] Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, et al. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia [J]. Eur J Biochem, 1980, 106(1): 7-16.

[36] Cheng T C. Lysosomal and other enzymes in the hemolymph of Crassostrea virginica and Mercenaria mercenaria [J]. Comp Biochem Physiol B, 1975, 52(3):443-447.