何慶國(guó) , 王劭雯 , 李加琦 , 劉 曉

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

藻類是皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)最重要的天然食物。鮑幼體階段主要攝食底棲硅藻, 幼鮑和成鮑則主要攝食褐藻、紅藻、綠藻等大型藻類。人工養(yǎng)鮑時(shí), 海帶(Laminaria japonica)是皺紋盤鮑最常用的飼料[1-2]。藻類的主要成分是多糖, 而皺紋盤鮑的多糖裂解酶在消化利用多糖類物質(zhì)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。鮑的多糖裂解酶很早就受到人們關(guān)注,1978年Clark等[3]報(bào)道了彩虹鮑(H. iris)消化腺提取液對(duì)14種多糖底物的水解酶活性, 并探討了這些酶作為商用酶制劑的可能性。此后, 中國(guó)學(xué)者也陸續(xù)報(bào)道了對(duì)皺紋盤鮑[4-7]和雜色鮑[8-10]多糖裂解酶的相關(guān)研究結(jié)果, 但上述研究均著眼于酶的活性或理化性質(zhì), 對(duì)它們的表達(dá)調(diào)控相關(guān)知識(shí)的了解仍很欠缺。

近10年來(lái), 皺紋盤鮑褐藻酸酶(hdaly)[11]、海帶淀粉酶(hdlam)[12]、纖維素酶(hdcel)[13]和盤鮑(H.discus discus)α-淀粉酶(hdamyl)[14]與纖維素酶[15]基因的 cDNA全長(zhǎng)序列相繼發(fā)表。為探討皺紋盤鮑對(duì)多糖類物質(zhì)的消化利用狀況, 作者根據(jù)已發(fā)表序列信息設(shè)計(jì)了相關(guān)引物, 嘗試在 mRNA水平研究這些酶的表達(dá)調(diào)控[16]。本研究使用的實(shí)驗(yàn)材料是中國(guó)科學(xué)院海洋研究所和大連市水產(chǎn)研究所培育的皺紋盤鮑“97”群體的選育第四代。該選育群體始建于1997年, 是以中國(guó)野生群體為母本與從日本巖手縣引進(jìn)的皺紋盤鮑進(jìn)行群體間雜交培育的雜交苗種經(jīng)過(guò)連續(xù)高強(qiáng)度選育而培育的皺紋盤鮑選育系。皺紋盤鮑“97”選育群體具有存活率高、適溫范圍廣、生長(zhǎng)速度快、整齊度高等特點(diǎn)[17], 作者從2008年開始對(duì)該選育群體開展了一系列的生理研究[16-18], 本文報(bào)道對(duì)皺紋盤鮑“97”選育群體 2齡成體消化酶基因表達(dá)研究的部分結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

供試樣品為皺紋盤鮑“97”群體選育第4代的2齡成鮑, 平均殼長(zhǎng)為(63.38±4.08)mm, 活體平均體重為(28.9±6.4)g。所用群體于2008年4月在山東榮成尋山漁業(yè)集團(tuán)總公司繁殖, 經(jīng)福建寧德海區(qū)完成越冬培育后在榮成桑溝灣海區(qū)籠養(yǎng)至次年11月, 海區(qū)養(yǎng)殖期間投喂的餌料為海帶。2009年12月至翌年4月, 在中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中培育, 期間每日投喂新鮮海帶, 由中科海WK-3000控溫儀(控溫精度<±0.1℃)與加熱棒調(diào)節(jié)培育水溫在(20±0.5)℃。

1.2 取樣

在20℃恒溫培育120 d后取部分個(gè)體, 逐個(gè)編號(hào)后分離每個(gè)個(gè)體的各種組織, 用 RNAwait試劑保存分離組織用于提取 RNA, 同時(shí)取足部肌肉于–80℃凍存用于提取DNA。

1.3 DNA和總RNA的提取

隨機(jī)取4個(gè)個(gè)體的足部肌肉組織, 采用SQ組織DNA提取試劑盒(Omega公司產(chǎn)品)提取DNA。同時(shí),分別取上述個(gè)體的消化腺、足部肌肉組織、外套膜、觸手、鰓組織, 采用總RNA提取試劑盒(BioFlux公司產(chǎn)品)提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物于－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的皺紋盤鮑 β-actin、褐藻酸酶、海帶淀粉酶、纖維素酶基因和盤鮑α-淀粉酶基因的cDNA序列信息, 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物, 引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物相關(guān)信息Tab.1 Primers used in this study

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測(cè)序

以皺紋盤鮑的DNA和cDNA為模板, 分別使用表 1中的引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)體系 20 μL, 含cDNA 2.5 ng, 正反向引物各10μmol/L, Taq酶 0.5U。擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s,72℃ 1 min, 共35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離, 目標(biāo)條帶回收后連接到質(zhì)粒載體 pMD18-T上, 轉(zhuǎn)化 E.coli Trans1-T1, 經(jīng) LB固體培養(yǎng)基 37℃培養(yǎng) 12～14h后,挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定, 陽(yáng)性克隆在LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)5～6h, 送交華大基因公司測(cè)序。

1.6 半定量PCR分析

以不同組織的cDNA為模板, 對(duì)4種多糖裂解酶基因進(jìn)行半定量PCR分析。反應(yīng)體系和條件同1.5。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 熒光定量PCR分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線: 對(duì)已知濃度的皺紋盤鮑消化腺cDNA進(jìn)行5倍比例稀釋, 共稀釋成4個(gè)濃度, 每個(gè)濃度2次重復(fù), 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以Ct值為縱坐標(biāo)、起始模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以皺紋盤鮑不同組織 cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增, 每個(gè)反應(yīng)重復(fù)4次。反應(yīng)體系如下: cDNA 1μL, 正反向引物各 1μL (10μmol/L), 2×SYBR Green預(yù)混液 10μL, 加雙蒸水到20μL。采用二步法進(jìn)行擴(kuò)增: 95℃ 預(yù)變性30 s后, 95℃變性5 s、60℃ 退火30 s, 共40個(gè)循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)對(duì)熒光定量 PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化, 使擴(kuò)增效率為 95%～105%, 采用 2–Δct法計(jì)算各目的基因相對(duì)于看家基因的表達(dá)量[18-19]。擴(kuò)增效率 E=10–1/K－1(K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。

數(shù)據(jù)顯著性采用SPSS(Ver.11.5)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)來(lái)表示。對(duì)測(cè)序結(jié)果, 應(yīng)用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增效率及熔解曲線分析

經(jīng)電泳檢測(cè), β-actin、hdaly、hdlam、hdamyl和hdcel的擴(kuò)增效率分別為96.6%、101.3%、104.4%、93.4%、96.4%。熔解曲線峰值基本一致, 無(wú)雜峰, 產(chǎn)物特異度好。

2.2 4種多糖裂解酶基因的擴(kuò)增結(jié)果

以皺紋盤鮑肌肉組織DNA和消化腺cDNA為模板, 分別用表1所列引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果見(jiàn)圖 1。由圖 1可知,β-actin和 4種多糖裂解酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰單一, 未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增; 以cDNA為模板所得擴(kuò)增片段在 100～200bp范圍內(nèi), 長(zhǎng)度與預(yù)期一致; 以DNA為模板擴(kuò)增時(shí), 褐藻酸酶與海帶淀粉酶基因的產(chǎn)物與 cDNA 模板所得產(chǎn)物大小相近, 但α-淀粉酶和纖維素酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物分別在 600bp和 800bp左右, 遠(yuǎn)大于以cDNA為模板的產(chǎn)物, 推測(cè)該區(qū)域存在內(nèi)含子序列。

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列和SNP

將圖1中P1-P9的產(chǎn)物分別克隆, 各取2個(gè)克隆測(cè)序。經(jīng)生物信息學(xué)分析知: (1)用cDNA模板分別擴(kuò)增得到β-actin基因、褐藻酸酶(hdaly)、海帶淀粉酶(hdlam)、α-淀粉酶(hdamyl)及纖維素酶(hdcel)基因片段的長(zhǎng)度分別為175 bp、116 bp、177 bp、188 bp和162bp, 產(chǎn)物長(zhǎng)度符合預(yù)期, 除纖維素酶基因片段存在 2個(gè)堿基差異外, 其他基因片段與盤鮑或皺紋盤鮑已發(fā)表基因的相應(yīng)片段一致; (2)纖維素酶基因片段的2個(gè)堿基差異位于其DNA全長(zhǎng)序列(AB125892.1)的第8349和第8361處, 分別是甘氨酸和蘇氨酸密碼子的末位堿基, 甘氨酸密碼子由GGC變?yōu)镚GT, 蘇氨酸由 ACT變?yōu)?ACC(圖 2), 均屬同義突變; (3)用DNA模板得到的纖維素酶(圖 2)和α-淀粉酶(圖 3)基因片段分別為 829bp和 626bp, 生物信息學(xué)分析確認(rèn)分別包含667bp和 438bp的內(nèi)含子序列。纖維素酶基因的內(nèi)含子序列與已發(fā)表序列相比, 存在 2個(gè)SNP(插入2個(gè)堿基)。

2.4 皺紋盤鮑多糖裂解酶基因表達(dá)的組織特異性

皺紋盤鮑不同組織的cDNA用表1所列引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖 4。可見(jiàn)內(nèi)參基因 β-actin在不同組織中的擴(kuò)增產(chǎn)物亮度基本一致, 但纖維素酶(hdcel)、α-淀粉酶(hdamyl)、褐藻酸酶(hdaly)和海帶淀粉酶(hdlam)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量在相同個(gè)體的不同組織間有極顯著差異, 均主要在消化腺中表達(dá)。但在鰓、足部肌肉組織、觸手和外套膜中也能檢測(cè)到α-淀粉酶(hdamyl)基因的微弱信號(hào)。

2.5 皺紋盤鮑 4種多糖裂解酶基因組織特異性表達(dá)的定量檢測(cè)

用Real-time PCR檢測(cè)4種多糖裂解酶基因在皺紋盤鮑不同組織中的相對(duì)表達(dá)量, 結(jié)果如表2所示?？梢?jiàn), 4種多糖裂解酶基因在消化腺中的相對(duì)表達(dá)量極顯著地高于其他組織, 相反, 在鰓、足部肌肉組織、外套膜和觸手等組織中的表達(dá)量則極低。并且,消化腺中 4種多糖裂解酶基因的相對(duì)表達(dá)量依次為褐藻酸酶＞纖維素酶＞α-淀粉酶＞海帶淀粉酶。此外, 褐藻酸酶和纖維素酶基因的表達(dá)量極顯著地高于α-淀粉酶和海帶淀粉酶(P<0.01)。

圖1 β-actin、hdaly、hdlam、hdamyl和hdcel的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of β-actin, hdaly, hdlam, hdamyl and hdcel gene

圖2 纖維素酶基因DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析Fig.2 Sequence analysis of DNA amplification products of cellulase gene

圖3 α-淀粉酶基因DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析Fig.3 Sequence analysis of DNA amplification products of α-amylase gene

表2 4種多糖裂解酶基因在皺紋盤鮑不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The expression of four polysaccharide lyase genes of Haliotis discus hannai Ino in different tissues

3 討論

圖4 皺紋盤鮑不同組織中4種多糖裂解酶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Four kinds of polysaccharide lyase gene expression tested by Semi-quantitative PCR

自然狀態(tài)下, 褐藻、紅藻和綠藻都是鮑的常見(jiàn)食物, 但混合投喂實(shí)驗(yàn)表明皺紋盤鮑成體優(yōu)先選擇褐藻[20]。褐藻酸是褐藻特有的重要多糖組分。我國(guó)生產(chǎn)上用于喂養(yǎng)皺紋盤鮑的最常用藻類是海帶, 且青島、大連地區(qū)收獲的海帶褐藻酸含量最高可達(dá)干品的約 30%[21]。與淀粉、纖維素等多糖不同, 褐藻酸由古羅糖醛酸和甘露糖醛酸 2種單糖組成, 而非葡萄糖。褐藻酸中的α-L-古羅糖醛酸(M)和β-D-甘露糖醛酸(G)各自或相互交替或無(wú)規(guī)則地通過(guò)1, 4糖苷鍵或少量的1, 5糖苷鍵連接成長(zhǎng)鏈狀的多糖分子[21]。本研究定量分析的皺紋盤鮑褐藻酸酶是 α-1, 4-聚古羅糖醛酸裂解酶, 該酶只水解褐藻酸大分子中相鄰L-古羅糖醛酸(M-M)間的α-1, 4糖苷鍵, 因此, 該酶的mRNA表達(dá)量可部分反映供試皺紋盤鮑對(duì)褐藻酸的消化利用情況。

實(shí)時(shí)定量PCR是定量研究基因表達(dá)的一種有效方法。本研究在轉(zhuǎn)錄水平對(duì) 4種多糖裂解酶基因在皺紋盤鮑“97”選育群體第 4代成體不同組織間的表達(dá)特征進(jìn)行了定量分析, 同時(shí)測(cè)定了 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。本研究結(jié)果表明, 皺紋盤鮑“97”群體選育第4代2齡成體消化腺中表達(dá)最強(qiáng)的是褐藻酸酶基因, 其次為纖維素酶基因, 相比之下, α-淀粉酶和海帶淀粉酶基因的表達(dá)量則低很多。2齡成鮑褐藻酸酶基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了α-淀粉酶和海帶淀粉酶的50倍以上(表2), 而此前已有研究報(bào)道攝食海帶的1齡幼鮑消化腺提取物對(duì)褐藻酸的水解活性高于對(duì)淀粉的水解活性[6]。綜合上述結(jié)果可見(jiàn), 在皺紋盤鮑消化腺中不僅褐藻酸酶mRNA表達(dá)量顯著高于纖維素酶與淀粉酶(表 2), 而且褐藻酸酶的活力水平也顯著高于淀粉酶[6]。據(jù)此推測(cè)成體皺紋盤鮑對(duì)褐藻酸的利用可能高于纖維素、淀粉等其他多糖。然而, 皺紋盤鮑喜食海帶等褐藻與其消化腺中褐藻酸酶基因的高表達(dá)是否相關(guān), 值得進(jìn)一步研究。

本文的結(jié)果為進(jìn)一步開展皺紋盤鮑“97”選育群體在不同發(fā)育期、攝食不同藻類及不同培育環(huán)境下的多糖水解酶基因表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。

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