張祥 許天源 夏磊磊 王先進 秦亮 朱照偉 鐘山 邵遠 沈周俊

在我國，膀胱癌的發(fā)病率位居男性全身惡性腫瘤的第七位，女性第十位，成為僅次于前列腺癌的第二大泌尿系統(tǒng)腫瘤［1-2］。近年來，雖然手術(shù)技術(shù)不斷提高，灌注藥物也不斷更新，但是非肌層浸潤性膀胱癌術(shù)后5年的復發(fā)率仍較高，因此構(gòu)建良好的膀胱癌動物模型及開展后續(xù)的相關(guān)研究便顯得極其重要。目前利用化學誘導劑構(gòu)建膀胱癌動物模型的方法主要有兩種：一種是通過給動物喂飼N-正丁基-N-（4-羥基-丁基）亞硝胺［N-butyl-N-（4-hydroxybutyl）nitrosamine，BBN］［3］，另一種則是通過將N-甲基亞硝基脲（N-methyl-nitrosourea，MNU）灌注于動物膀胱從而構(gòu)建膀胱癌的動物模型［4］。雖然上述技術(shù)均較為成熟，但在判斷建模是否成功時，通常是將動物處死后進行膀胱組織的病理切片檢查，因此實驗者無法對建模后的動物進一步進行體內(nèi)實驗研究。本課題組曾采用CT掃描的方法來檢測大鼠活體的原位膀胱成瘤情況［5］。盡管該方法具有良好的診斷價值，但價格相對昂貴，且CT檢查具有放射性。超聲檢查是臨床上膀胱癌診斷、隨訪常用的影像學檢查手段，具有價格相對便宜、操作簡單、無放射性等優(yōu)點，且對膀胱組織無任何不良影響。我們對膀胱癌建模大鼠活體進行超聲檢查，并在大鼠處死后進行膀胱組織的病理學檢查，以評估超聲檢查對大鼠膀胱癌建模效果的診斷價值。

材料與方法

一、主要試劑

MNU購自美國Sigma公司（2g瓶裝混合物，純度50%）。枸櫞酸鈉緩沖液的配置：枸櫞酸4.2g，氫氧化鈉2.1g，加去離子水240ml振搖使之溶解，用5mol／L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，再加去離子水至250ml，搖勻即可。將緩沖液50ml注入MNU瓶中，配置成濃度為20mg／ml的MNU溶液。對溶液進行3ml分裝，置于-20℃冰箱保存。BBN購自日本東京Kasei公司，加0.005%Tween80作為乳化劑，再加入蒸餾水配置成濃度為0.05%的溶液。

二、實驗動物及分組

選用SPF級SD雌性大鼠60只［12周齡左右，體重（200±10）g］，由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院實驗醫(yī)學研究中心提供并飼養(yǎng)［SCXK（滬）2011-0113］。實驗大鼠采用打耳孔法標記。隨機分為BBN組和MNU組。

三、實驗方法

BBN組：隨機分為誘癌組和對照組。誘癌組20只，每日給予BBN溶液喂養(yǎng)，將BBN溶液灌入飲水瓶中，每日飲水投入，連續(xù)6周，后更換為2%的枸櫞酸鈉溶液連續(xù)喂養(yǎng)22周。對照組10只，只給予清水喂養(yǎng)，共28周。MNU組：隨機分為誘癌組和對照組。誘癌組20只，給予 MNU溶液（20mg／ml）膀胱灌注，每兩周1次，每次0.1ml／只，共4次；8周誘導結(jié)束后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)6周。對照組10只，給予PBS膀胱灌注，方法同誘癌組。灌注前需將大鼠用2%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔麻醉。整個實驗過程中對于大鼠嚴格按照3R原則給予人道關(guān)懷［3-4］。

四、超聲掃描

超聲掃描采用德國Visual Sonics公司生產(chǎn)的VEVO770小動物超聲影像系統(tǒng)（超聲探頭型號703，分辨率50μm，頻率52.5MHz）。對于 MNU組大鼠，于實驗第14周末進行檢測。檢測前以2%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定。將大鼠下腹部毛發(fā)剃除干凈，0.1%新潔爾滅溶液消毒外陰部，用長約6cm自制導尿管從尿道外口插入膀胱，抽出尿液后灌注1.0～1.5ml生理鹽水使膀胱充盈。以超聲探頭緊貼下腹部掃描，記錄結(jié)果。BBN組于實驗第28周末采用相同方法進行超聲檢查。

五、膀胱組織病理學檢查

誘癌周期結(jié)束后，經(jīng)超聲掃描各組大鼠，然后采用過量麻醉法處死。觀察大鼠的膀胱、腎臟及輸尿管形態(tài)變化。取新鮮膀胱組織，經(jīng)固定、包埋、切片、HE染色后，置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和腫瘤類別。

六、統(tǒng)計學方法

比較兩組的存活率和存活成瘤率，實驗數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、一般情況

BBN組中的誘癌組大鼠9只死亡，死亡大鼠于飼養(yǎng)第2周后出現(xiàn)活動減少，死亡時大鼠較開始時出現(xiàn)明顯的萎縮現(xiàn)象，毛發(fā)暗淡，考慮死于全身代謝中毒；存活11只，其中5只可見明顯的血尿癥狀。BBN組中的對照組大鼠無死亡，無異常癥狀。MNU組大鼠一般于麻醉后2h開始蘇醒，4h正常活動。MNU組中的誘癌組大鼠死亡2只（1只死于感染，尸體解剖后發(fā)現(xiàn)腎膿腫；1只死于麻醉后窒息），存活18只，存活的18只中有17只出現(xiàn)血尿癥狀。MNU組中的對照組大鼠死亡1只，考慮死于麻醉過量。

二、超聲掃描結(jié)果

BBN組中誘癌組超聲檢查發(fā)現(xiàn)存活的11只大鼠中有8只大鼠的膀胱出現(xiàn)新生物，在矢狀位和冠狀位均可見較小的新生物，且浸潤程度較淺（圖1A、1B），其中有5只呈乳頭狀突起伴黏膜固有層浸潤，其余3只為淺肌層浸潤。對照組超聲檢查無異常發(fā)現(xiàn)（圖1C）。MNU組中誘癌組超聲檢查發(fā)現(xiàn)17只大鼠膀胱出現(xiàn)新生物，在矢狀位和冠狀位均可見較大的腫瘤新生物，且浸潤較深（圖2A、2B），其中可觀察到3只大鼠為乳頭狀突起伴黏膜固有層浸潤，6只大鼠浸潤到淺肌層，其余均浸潤至深肌層。對照組無異常發(fā)現(xiàn)（圖2C）。

圖1 A：矢狀位可見膀胱壁表面新生物（BBN誘癌組）；B：冠狀位可見浸潤程度較淺的新生物（BBN誘癌組）；C：膀胱壁黏膜正常，無異常發(fā)現(xiàn)（BBN組中的對照組）

圖2 A：矢狀位可見膀胱壁表面巨大的腫瘤新生物（MNU誘癌組）；B：冠狀位可見彌漫生長的腫瘤新生物（MNU誘癌組）；C：膀胱壁黏膜正常，無異常發(fā)現(xiàn)（MNU組中的對照組）

三、膀胱標本病理肉眼及組織切片結(jié)果

BBN誘癌組存活11只，處死后有8只膀胱內(nèi)可見腫瘤新生物，腫瘤體積較小，多數(shù)呈乳頭狀（圖3A），與超聲觀察結(jié)果一致。病理檢查可見腫瘤新生物浸潤程度較淺（圖3B），浸潤程度與超聲檢查結(jié)果一致，且腫瘤異型性較明顯（圖3C）。MNU誘癌組存活18只，處死后有17只膀胱內(nèi)可見明顯的腫塊，多數(shù)呈彌漫狀生長（圖3D），與超聲檢查結(jié)果一致。病理檢查可見腫瘤浸潤程度較深（圖3E），部分已經(jīng)深達深肌層，腫瘤浸潤程度與超聲檢查結(jié)果一致，腫瘤異型性較BBN組更加明顯（圖3F）。

圖3 A：BBN造模后的米粒樣腫物；B：浸潤程度較淺（BBN誘癌組，HE染色，×400）；C：腫瘤異型性較明顯（BBN誘癌組，HE染色，×200）；D：MNU造模后可見巨大腫塊（MNU誘癌組）；E：浸潤程度明顯，已達深肌層（MNU誘癌組，HE染色，×400）；F：腫瘤異型性更加明顯（MNU誘癌組，HE染色，×200）

四、統(tǒng)計結(jié)果

BBN組中的誘癌組喂養(yǎng)28周后存活11只，成瘤8只，存活率為55%，存活成瘤率為72.7%。MNU組中的誘癌組喂養(yǎng)14周后存活18只，成瘤17只，存活率為90%，存活成瘤率為94.4%。BBN組中誘癌組與對照組存活成瘤率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MNU組中誘癌組與對照組存活成瘤率比較差異有統(tǒng)計學意義。BBN誘癌組與MNU誘癌組存活成瘤率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。超聲檢查出的大鼠成瘤率以及腫瘤浸潤程度與各組病理檢查結(jié)果一致，陽性率為100%。

討 論

膀胱癌在泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率一直高居前列，雖然目前各種手術(shù)技術(shù)已經(jīng)相當成熟，但是膀胱癌的術(shù)后復發(fā)率仍較高。一般膀胱癌術(shù)后會采用預防性的化療，但這依然不能夠明顯降低總體的術(shù)后腫瘤復發(fā)率。因此構(gòu)建良好的腫瘤動物模型，對研究膀胱癌的繼續(xù)治療具有至關(guān)重要的作用。膀胱癌的病因復雜多變，但是膀胱中持續(xù)的致癌物的存在是主要原因之一，同時也是膀胱癌治療后復發(fā)的原因之一。自1937年Hueper首次論證2-奈胺可以誘導膀胱癌以來，許多化學物質(zhì)都被證明可以誘導膀胱癌的動物模型［6］，目前主要使用的兩種化學物質(zhì)分別是BBN和MNU。MNU為亞硝基類化合物，其主要是通過使細胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)產(chǎn)生烷化作用，特別是核酸的鳥嘌呤分子發(fā)生烷化而產(chǎn)生誘癌作用，為直接誘癌物［7］。BBN為間接致癌物，它通過在體內(nèi)產(chǎn)生N-丁基-N-（3-羧丙基）亞硝基胺后經(jīng)尿路排泄，從而造成上皮細胞的DNA損傷產(chǎn)生致癌作用，這種致癌效果主要局限在動物的膀胱內(nèi)［8］。這兩種物質(zhì)的致癌作用都是通過刺激尿路上皮而產(chǎn)生致癌作用，所誘發(fā)的腫瘤類型均與人類相似。因此通過研究BBN和MNU的腫瘤動物模型以進一步研究膀胱癌的病因、治療、治療后高復發(fā)率的原因以及預防有著極其重要的作用。但是由于BBN和MNU致癌作用的途徑不同，兩者在構(gòu)建動物模型上也各有其優(yōu)缺點。

BBN造模方法簡單易行，只需每日給予飲水飼養(yǎng)，無需對大鼠做任何侵入性的操作。因此更接近自然情況下的誘癌機制。此方法適用性廣，雌、雄鼠以及裸鼠均可以采用此方法誘癌。但是由于每只大鼠對環(huán)境的適應度不同以及每只大鼠的代謝能力、攝水量亦不同，使得進入大鼠體內(nèi)的藥物量難以準確計算，因此成瘤率較低（本實驗BBN誘癌組存活成瘤率為72.7%）。BBN需經(jīng)代謝后產(chǎn)生N-丁基-N-（3-羧丙基）亞硝基胺從而產(chǎn)生致癌作用，對全身傷害性較大，尤其是對肝、腎的傷害最大，因此大鼠死亡率高。此外BBN造模時間較長，大大增加了大鼠意外死亡的發(fā)生率（本實驗BBN誘癌組存活率為55%，較對照組及MNU誘癌組明顯下降）。

MNU造模方法可以準確控制藥物的給藥劑量，且可以控制藥物只局限在動物的膀胱內(nèi)，而不會對大鼠除泌尿系統(tǒng)以外的器官產(chǎn)生損傷，因此大鼠存活率要明顯高于BBN誘癌組（本實驗MNU誘癌組存活率為90%，而BBN誘癌組存活率為55%）。因膀胱灌注后對尿道采取短時間的夾閉，藥物可以在膀胱內(nèi)保持一個較高的濃度，因此成瘤率較BBN組明顯高且時間較短（本實驗MNU誘癌組存活成瘤率為94.4%，高于BBN誘癌組）。但是MNU造模法為侵入性操作，對膀胱所產(chǎn)生的刺激性較大且有一定的損傷性，大鼠感染率較高。由于需要導尿，使用范圍較為局限，對雄性大鼠和小鼠不適用。從超聲和病理結(jié)果也可以看出MNU組腫瘤浸潤程度較深，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)腫瘤異型性更加明顯，造模效果要優(yōu)于BBN組。

大鼠造模成功后，將大鼠處死并進行病理學檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤組織為確定造模成功的金標準。但是研究者對大鼠進行造模的目的往往是為了進一步做一些體內(nèi)實驗，如向膀胱內(nèi)注射化療藥物，觀察抗腫瘤效果。因此這就要求我們采用非處死且準確率較高的方法來檢驗成瘤效果。本課題組曾采用CT掃描來鑒定大鼠的原位癌造模效果，但是CT的放射性強，對腫瘤的生物學行為可能存在一定的影響。在本實驗中我們采用高頻超聲的方法來檢測腫瘤的生長情況，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，超聲可檢測出膀胱內(nèi)有新生物的大鼠，與病理檢測結(jié)果相一致。在檢測過程中我們通過不斷改變探頭的位置，觀察膀胱壁上腫瘤的情況，可判斷出腫瘤生長的具體位置以及腫瘤基底部的情況。在本實驗中，超聲檢查可以準確判斷出腫瘤浸潤至膀胱壁的深度（BBN誘癌組和MNU誘癌組超聲所檢查出的腫瘤浸潤程度與最終病理檢查結(jié)果完全一致）。因此可以通過超聲對大鼠膀胱癌動物模型建立的成功與否以及腫瘤的生長情況進行檢測，為實驗的進一步研究提供了一種簡單易行且價格低廉的操作方法。

綜上所述MNU造模成功率較BBN高，且時間短，降低了大鼠的意外死亡率。超聲可用于大鼠原位膀胱癌造模后的活體檢測，為后續(xù)研究創(chuàng)造了可能性。

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