金露 李一帆 陳獨(dú)群 蘇鄭明 劉家駒 楊尚琪 桂耀庭 毛向明 來永慶

腎細(xì)胞癌又稱腎癌，約占成人惡性腫瘤的3%，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中致死率最高的腫瘤［1-2］。最近的腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在美國(guó)腎癌的發(fā)生率和死亡率均位于前十，僅2013年腎癌的新發(fā)病例就有65 150例，而且有8 780例死于腎癌［3］。腎癌發(fā)生的早期無相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，患者多在體檢或做其他疾病檢查時(shí)被發(fā)現(xiàn)，約30%的患者因遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癥狀而就診［4］。如果不予治療，腎細(xì)胞癌的5年生存率約為2%，生存時(shí)間的中位數(shù)約8個(gè)月［5］。目前腎癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明確，臨床也尚未應(yīng)用一些生物標(biāo)志物來診斷、治療腎癌或評(píng)估其預(yù)后。因此，以腎癌的發(fā)生機(jī)制為基礎(chǔ)來尋找可用于腎癌早期診斷或靶向治療、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物是很有必要的。

微小RNA（MicroRNA／miRNA／miR）是一種短鏈非編碼RNA，約有22個(gè)核苷酸，miRNA能非特異性結(jié)合mRNA上的靶基因，通過使其降解或抑制其轉(zhuǎn)錄來調(diào)控基因的表達(dá)［6-7］。研究表明，miRNA在多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程中均扮演著重要的角色，包括細(xì)胞的增殖、分化、新陳代謝和凋亡等［7-8］。截至目前，在大量人類的癌組織中都發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達(dá)或突變。據(jù)推測(cè)，超過60%的人類蛋白編碼基因都能和miRNA結(jié)合［9］。另外，miRNA在人血清中不容易被降解而且穩(wěn)定存在，容易被檢測(cè)，是良好的生物標(biāo)記物［10-11］。為了探究miR-20b在腎癌中的作用機(jī)制，本研究以前期測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)腎癌和癌旁組織中具有差異表達(dá)的miR-20b進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證比較，分析miR-20b的表達(dá)量是否與患者臨床病理特點(diǎn)有關(guān)，為miR-20b在腎癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制以及其在腎癌中的診斷價(jià)值等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、研究標(biāo)本與臨床資料

本研究隨機(jī)選取42例深圳市重大疾病臨床資料和生物資源標(biāo)本庫(kù)保存的腎癌及其配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本（2010年1月至2013年10月收集于安徽、北京、深圳等各大醫(yī)院，每例標(biāo)本均為手術(shù)切除，且均得到就診醫(yī)院和北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意，簽署知情同意書）。每例標(biāo)本包括經(jīng)病理切片證實(shí)的腎癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織（取自根治性腎切除術(shù)距離癌組織＞5cm的正常腎組織，且經(jīng)病理證實(shí)無癌組織浸潤(rùn)）各1份，患者均有完整的臨床病理資料（表1）。標(biāo)本來源的腎癌患者包括女15例，男27例，平均年齡50.28（14～78）歲，中位年齡53歲。組織學(xué)分類采用WHO2004年腎細(xì)胞癌病理分類標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期則采用2009年國(guó)際抗癌組織（UICC）／美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）臨床分期標(biāo)準(zhǔn)。

二、主要試劑和儀器

RNA 提取試劑 Trizol（Invitrogen，USA），microRNA 熒光試劑 miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany），microRNA 專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit（Qiagen，Germany），NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA），普 通 RT-PCR 儀 （BIO-RAD，USA），LC 480 熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems，USA），常規(guī)試劑及儀器等由北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖與遺傳中心實(shí)驗(yàn)室所提供。

三、miRNA的前期測(cè)序及篩選

本研究前期測(cè)序由深圳華大基因研究所采用Illumina Hiseq2000測(cè)序儀完成。通過第二代測(cè)序方法篩選在腎癌組織和癌旁配對(duì)正常組織中表達(dá)有差異的miRNAs。因目前在其他腫瘤組織中已經(jīng)有關(guān)于miR-20b作為促癌因素的報(bào)道，而腎癌組織中miR-20b表達(dá)下調(diào)，提示其在腎癌發(fā)生發(fā)展中有著不同的作用機(jī)制，因此本研究選用差異表達(dá)的miR-20b［log2（T／N）＝-0.89，P＝0.030 3］作為研究對(duì)象進(jìn)行進(jìn)一步的研究及探討。

四、總RNA的提取

將選取的42例標(biāo)本在液氮下碾磨后，按照說明書使用Trizol試劑提取碾磨后標(biāo)本中的總RNA，之后測(cè)定提取得到的總RNA濃度（使用NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)測(cè)定）。

五、總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

根據(jù) miScript Reverse Transcription Kit說明書所述，在反應(yīng)體系中加入1μg總RNA，在普通PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37℃60min，95℃5min。合成的cDNA置于-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

六、RT-qPCR檢測(cè)miR-20b

根據(jù) miScript SYBRGreen PCR Kit說明書所述，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版在LC 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：模板cDNA 1μl，2＊QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix 10μl，miR-20b上游引物1μl，10＊miScript通用引物2μl，加無酶水至總反應(yīng)體積20μl。miR-20b上游引物為5′-AAGTGCTCATAGTGCAG-3′，下游引物使用Qiagen公司提供的通用引物。內(nèi)參基 因 采 用 U6snRNA，其 上 游 引 物 是：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95℃15min，94℃15s，之后55℃30s，70℃30s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。

七、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以U6為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，RT-qPCR所得數(shù)據(jù)使用ΔΔCT法分析：ΔCT＝ CTmiR-20b-CTU6，ΔΔCT＝ΔCTRCC-ΔCTNormal。通過計(jì)算2-△CT將得到的ΔCT值還原為miR-20b的相對(duì)表達(dá)量，經(jīng)過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，符合正態(tài)分布。通過計(jì)算2-△△CT得到癌組織中miR-20b表達(dá)量相對(duì)于配對(duì)癌旁組織表達(dá)量的倍數(shù)，采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較腎癌和癌旁正常組織中miR-20b表達(dá)水平，采用四格表χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率分析miR-20b表達(dá)水平與患者的臨床病理特征的聯(lián)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-20b在腎癌及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)量

miR-20b在腎癌組織中的表達(dá)水平明顯低于配對(duì)癌旁組織。通過2-△CT計(jì)算miR-20b在腎癌組織和配對(duì)組織中的相對(duì)表達(dá)量并作圖，結(jié)果如圖1所示，配對(duì)t檢驗(yàn)分析P＜0.05。通過2-△△CT計(jì)算miR-20b在腎癌組織中表達(dá)量相對(duì)配對(duì)癌旁組織表達(dá)量倍數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，為1.020±0.210，最小值為0.051，最大值為7.013；其中，表達(dá)量倍數(shù)高于1.020＋0.210的視為表達(dá)上調(diào)，低于1.020-0.210的視為表達(dá)下調(diào)，其余則為表達(dá)無明顯差異。腎癌組織miR-20b表達(dá)量與配對(duì)癌旁組織表達(dá)量比值進(jìn)行l(wèi)og2（T／N）轉(zhuǎn)換，結(jié)果如圖2所示，表達(dá)下調(diào)的為29例（69.048%），表達(dá)上調(diào)的為11例（26.190%），表達(dá)無明顯差異的為2例（4.762%）。

二、miR-20b表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性

以腎癌組織miR-20b相對(duì)表達(dá)量平均值1.104為界，將研究病例分為高表達(dá)組、低表達(dá)組，其中低表達(dá)29例，高表達(dá)13例。按性別分為男性組及女性組，以患者年齡中位數(shù)51歲為界將患者分為＜51歲組和≥51歲組。進(jìn)行四格表χ2檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示腎癌中miR-20b表達(dá)水平與患者年齡、腎癌組織類型、性別、AJCC臨床分期、TNM分期無明顯相關(guān)性（P＞0.05），結(jié)果見表1。但該研究結(jié)果不能排除病例數(shù)較少所致偏倚，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖1 miR-20b在腎癌組織和癌旁組織中的ΔCT比較（ΔCT＝CTmiR-20b-CTU6）

圖2 miR-20b在42例配對(duì)的腎癌和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量比值（橫坐標(biāo)為標(biāo)本序號(hào)，縱坐標(biāo)為miR-20b在腎癌與正常組織中表達(dá)量比值的對(duì)數(shù)值；條帶：灰色為表達(dá)下調(diào)，黑色為表達(dá)上調(diào)，白色為表達(dá)無明顯差異）

表1 miR-20b表達(dá)量與臨床病理特征之間的關(guān)系

討 論

和大多數(shù)腫瘤一樣，腎癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制尚不清楚。三分之一的腎癌患者在初次診斷時(shí)已經(jīng)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中近30%的病例手術(shù)后會(huì)有復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移［2］。因此尋找可用于腎癌早期診斷的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些和腎癌診斷及惡性程度相關(guān)的生物標(biāo)志物，但在臨床上并無相關(guān)標(biāo)志物的應(yīng)用，關(guān)于這些標(biāo)志物的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。現(xiàn)階段常規(guī)的臨床分期和病理分期在腎癌預(yù)后的判斷中仍起主要作

用［12］。

從miRNA被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，人們對(duì)miRNA的研究在逐漸深入。多項(xiàng)研究表明，miRNAs在多種腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)，比如在黑色素瘤中低表達(dá)的 miR-205、miR-211［13］，在結(jié)腸癌中高表達(dá)的miR-31［14］，因此根據(jù)miRNA的表達(dá)水平不同可以把miRNA分為促癌miRNA和抑癌miRNA，即腫瘤組織中高表達(dá)的miRNA可能起到類似于促癌基因的作用，而低表達(dá)的miRNA可能具有抑癌基因的作用。在一定的條件下，miRNA通過非特異性結(jié)合靶基因mRNA3′端非編碼區(qū)來抑制其轉(zhuǎn)錄或使其降解來調(diào)控靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮著基因調(diào)控作用［15-16］。由于 miRNA結(jié)合的不完全性，一個(gè)miRNA可以和多個(gè)基因結(jié)合，而多個(gè)miRNA也可以和同一個(gè)基因結(jié)合，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前在腫瘤的靶向治療方面，靶點(diǎn)的選擇只是局限于單個(gè)異?；颍玬iRNA可以和多個(gè)基因位點(diǎn)結(jié)合，通過調(diào)節(jié)組織中miRNA的水平即可達(dá)到同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因的目的。因此，在腫瘤的分子靶向治療方面miRNA有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，所以有必要深入研究miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，以期在腫瘤分子靶向治療方面取得新的突破。

在先前測(cè)序及篩選的基礎(chǔ)上，本研究通過逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測(cè)標(biāo)本中miR-20b的表達(dá)水平，并分析其與病例臨床特征的相關(guān)性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-20b表達(dá)水平與患者臨床特征無明顯相關(guān)性?，F(xiàn)階段的研究表明，miR-20b在其他病變組織中也存在著異常表達(dá)。目前已有報(bào)道證實(shí)在乳腺癌中miR-20b表達(dá)水平升高，且可通過作用于人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因來促進(jìn)細(xì)胞增殖［17］。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-20b可以通過和RORγt、STAT3結(jié)合來抑制Th17細(xì)胞的分化以及腦脊髓炎的發(fā)生［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在腎癌細(xì)胞中表達(dá)下降，表明其在腎癌中的作用機(jī)制與在乳腺癌中有所不同。miR-20b在腎癌組織中明顯的低表達(dá)，其表達(dá)水平是癌旁組織的1.020±0.210倍，提示其可能在基因調(diào)控方面發(fā)揮著抑癌基因的作用，這可能在腎癌的早期診斷及預(yù)后判斷方面有一定的臨床意義。確定miR-20b表達(dá)存在差異后，下一步將是收集更多腎癌標(biāo)本檢測(cè)miR-20b的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-20b與腎癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系并通過體外轉(zhuǎn)染的方法對(duì)miR-20b進(jìn)行功能研究，主要包括研究轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力、凋亡水平等方面的變化。目前普遍認(rèn)為，miRNA通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，因此我們下一步的研究將是如何有效地將特異性較高的miR-20b和其抑制物導(dǎo)入到腎癌細(xì)胞中，通過對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的功能研究，進(jìn)一步明確miR-20b在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)水平與患者臨床病理特征無明顯相關(guān)性。目前關(guān)于miR-20b的功能研究尚處于探索階段，但根據(jù)目前研究狀況，探究其對(duì)癌細(xì)胞功能的影響，尋找其靶基因及作用通路已成為明確目標(biāo)。本研究為miR-20b在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制以及其在腎癌中的診斷價(jià)值等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Alt AL，Boorjian SA，Lohse CM，et al.Survival after complete surgical resection of multiple metastases from renal cell carcinoma［J］.Cancer，2011，117（13）：2873-2882.

［2］ Tostain J，Li G，Gentil-Perret A，et al.Carbonic anhydrase 9in clear cell renal cell carcinoma：A marker for diagnosis，prognosis and treatment［J］.Eur J Cancer，2010，46（18）：3141-3148.

［3］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［4］ Li M，Zhang G，Zhang X，et al.Overexpression of B7-H3in CD14（＋）monocytes is associated with renal cell carcinoma progression［J］.Med Oncol，2014，31（12）：349.

［5］ Rasmussen F.Metastatic renal cell cancer［J］.Cancer Imaging，2013，13（3）：374-380.

［6］ Coskun M，Bjerrum JT，Seidelin JB，et al.miR-20b，miR-98，miR-125b-1＊，and let-7e＊as new potential diagnostic biomarkers in ulcerative colitis［J］.World J Gastroenterol，2013，19（27）：4289-4299.

［7］ Hoheisel JD，Wang X，Sundquist J，et al.Determination of 14Circulating microRNAs in Swedes and Iraqis with and without Diabetes Mellitus Type 2［J］.PloS one，2014，9（1）：e86792.

［8］ Juan D，Alexe G，Antes T，et al.Identification of a MicroR-NA Panel for Clear-cell Kidney Cancer［J］.Urology，2010，75（4）：835-841.

［9］ Friedman RC，F(xiàn)arh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92-105.

［10］ Grange C，Collino F，Tapparo M，et al.Oncogenic micro-RNAs and renal cell carcinoma［J］.Front Oncol，2014，4：49.

［11］ Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31（6）：659-666.

［12］ Wood CG.Molecular markers of prognosis in renal cell carcinoma：Insight into tumor biology helps define risk and provides targets for therapy［J］.J Surg Oncol，2006，94（4）：264-265.

［13］ Xu Y，Brenn T，Brown ER，et al.Differential expression of microRNAs during melanoma progression：miR-200c，miR-205and miR-211are downregulated in melanoma and act as tumour suppressors［J］.Br J Cancer，2012，106（3）：553-561.

［14］ Wang S，Hu J，Zhang D，et al.Prognostic role of microRNA-31in various cancers：a meta-analysis［J］.Tumour Biol，2014，35（11）：11639-11645.

［15］ Xu L.miR-203regulates the proliferation，apoptosis and cell cycle progression of pancreatic cancer cells by targeting Survivin［J］.Mol Med Rep，2013，8（2）：379-384.

［16］ Zhai Q，Zhou L，Zhao C，et al.Identification of miR-508-3p and miR-509-3p that are associated with cell invasion and migration and involved in the apoptosis of renal cell carcinoma［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，419（4）：621-626.

［17］ Zhou W，Shi G，Zhang Q，et al.MicroRNA-20bpromotes cell growth of breast cancer cells partly via targeting phosphatase and tensin homologue（PTEN）［J］.Cell Biosci，2014，4（1）：62.

［18］ Zhu E，Wang X，Zheng B，et al.miR-20bsuppresses Th17 differentiation and the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis by targeting RORgammat and STAT3［J］.J Immunol，2014，192（12）：5599-5609.