孫圣福 陳靜 田夫林 馬惠玲 楚遵鋒 王敏（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 250022）

日本乙型腦炎LAMP方法的建立和應(yīng)用

孫圣福 陳靜 田夫林 馬惠玲 楚遵鋒 王敏（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 250022）

日本乙型腦炎（Japaneseencephalitis，JE，簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦）是一種由乙型腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）引起的人畜共患的病毒性疾病。對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物的健康有極大的威脅，主要引起人的神經(jīng)性疾病以及豬的繁殖障礙。

本研究針對(duì)乙型腦炎病毒的M基因設(shè)計(jì)一套R(shí)T-LAMP特異性引物，建立了用于乙腦病毒快速診斷的病原學(xué)檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便，時(shí)間短，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，檢測(cè)結(jié)果肉眼下即可觀察結(jié)果，臨床應(yīng)用簡(jiǎn)便。

1 材料和方法

1.1 材料

病毒：乙腦減毒克隆98株；臨床病料來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室門(mén)診采集自山東省各市縣養(yǎng)豬場(chǎng)疑似乙腦的病料。

1.2 主要儀器和試劑

凝膠成像及分析系統(tǒng)為美國(guó)BIO-RADGEL型，PCR儀為德國(guó)Biometra公司生產(chǎn)的Tgradient型，臺(tái)式冷凍離心機(jī)為德國(guó)Sigma2k-15型，生物安全柜為NU-425-400E3型，電泳槽為北京六一儀器廠。

Loopamp試劑盒購(gòu)自榮研株式會(huì)社，SYBRGREENI核酸染料購(gòu)自Solarbio公司；DL2000DNAMarker、20bpLadder DNAMarker、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自大連寶生物公司。日本乙腦RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 引物

根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的JEV的M基因，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV4.0設(shè)計(jì)出RT-LAMP反應(yīng)中使用的4條特異性引物，引物由TAKARA公司合成，序列如下：

表1 引物序列

1.4 核酸提取

待檢樣品100ul，加Trizol試劑1ml。充分混勻，室溫5min，加三氯甲烷 200ul，混勻，室溫 5min。12000rpm，15min（2～8℃），取上清80%于另一離心管，加入500ul異丙醇， 混勻， 室溫 10min， 12000rpm， 10min（2～8℃）， 棄上清，加75%乙醇洗滌，7500rpm，5min（2～8℃），棄上清，風(fēng)干，加20ul0.1%DEPC水溶解，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-LAMP體系優(yōu)化

根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，對(duì)反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)溫度依次：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，甜菜堿濃度分別為0.5、1、1.5、2M，內(nèi)引物濃度分別為1.2、1.6、2.0、2.4μM，外引物濃度分別為0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0μm，反應(yīng)時(shí)間：20、30、45、60min，確定最佳的反應(yīng)體系，25μl反應(yīng)體系：F3/B3 0.2μm、 FIP/BIP1.6μm、 dNTP0.4mm、 MgSO44mm、 Betaine1M、 BstDNA 聚合酶 1μl、 10×Thermobuffer2.5μl、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶10U，RNA酶抑制劑20U，模板2μl，ddH2O補(bǔ)齊至 25μl。 63℃45min， 80℃2min。 取 6μl擴(kuò)增產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，剩余產(chǎn)物中加入1μl核酸染料觀察顏色變化。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別以豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒等作為樣品，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，提取核酸，采用已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)條件，檢驗(yàn)所建立的RT-LAMP方法的特異性。

1.7 靈敏性試驗(yàn)

將病毒樣品進(jìn)行 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6進(jìn)行十倍比稀釋?zhuān)崛『怂?，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，提取核酸，采用已經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)條件，檢驗(yàn)所建立的RT-LAMP方法的靈敏性；同時(shí)進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，比較兩種方法的靈敏性。

1.8 臨床應(yīng)用

采集臨床繁殖障礙的豬組織樣品27份，提取核酸，采用建立的RT-LAMP方法和RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

參見(jiàn)圖1～圖4。

圖1 不同溫度梯度

圖2 不同甜菜堿濃度

圖3 不同引物濃度梯度

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間

2.2 RT-LAMP特異性試驗(yàn)

參見(jiàn)圖5。

圖5 RT-LAMP特異性試驗(yàn)

2.3 RT-LAMP靈敏性試驗(yàn)

參見(jiàn)圖6～圖7。

圖6 RT-LAMP靈敏性試驗(yàn)

圖7 RT-PCR靈敏性試驗(yàn)

2.4 臨床應(yīng)用

乙腦RT-LAMP臨床應(yīng)用情況，見(jiàn)表2。

表2 乙腦RT-LAMP臨床應(yīng)用情況

3 結(jié)論

（1）通過(guò)RT-LAMP反應(yīng)條件篩選，確定了乙型腦炎R(shí)T-LAMP的最佳反應(yīng)條件。

（2）通過(guò)靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)，確定RT-LAMP能特異性的檢測(cè)乙腦病毒，檢測(cè)靈敏度為10-5，而RT-PCR檢測(cè)靈敏度為10-3，RT-LAMP的靈敏性較RT-PCR高100倍。

（3）RT-LAMP方法反應(yīng)條件為63℃，只用一個(gè)水浴鍋即可完成試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果眼觀，更為直觀，因此適于臨床上應(yīng)用。

作者：孫圣福（1978-），山東省聊城市人，主要從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷工作。

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題——規(guī)?；i場(chǎng)豬繁殖障礙病防治與快速檢測(cè)技術(shù)的研究。