周建偉賈印峰王 麗孔 翠金呈強(qiáng)董海新

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，山東濟(jì)寧272029；2.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)寧272011；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院護(hù)理部，山東濟(jì)寧272029

2例1型糖尿病患者外周血TCR Vβ7分子結(jié)構(gòu)模擬與分析

周建偉1賈印峰1王 麗2孔 翠3金呈強(qiáng)1董海新1

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，山東濟(jì)寧272029；2.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)寧272011；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院護(hù)理部，山東濟(jì)寧272029

目的 模擬和分析2例1型糖尿病（T1D）患者外周血TCR Vβ7的結(jié)構(gòu)。 方法 以熒光定量PCR熔解曲線分析技術(shù)檢測T1D患者外周血TCR Vβ7的譜系漂移，利用IMGT數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)軟件（CPH Models 2.0 Server和 RasMol 2 Software）模擬分析其分子結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 2例T1D患者外周血的TCR Vβ7擁有極為相似的氨基酸序列“CASRTAGQYEQYFGPGTR”和“CASRTAGQYEQFFGPGTR”，唯一不同的是第十二個氨基酸殘基，前者為酪氨酸（Y），后者為苯丙氨酸（F）。分子模擬顯示，兩者TCR Vβ7基因結(jié)構(gòu)明顯不同。 結(jié)論 不同T1D患者來源的TCR Vβ7即使具有相似或相同的氨基酸序列，分子結(jié)構(gòu)未必相同；其可能來自于不同的T細(xì)胞克隆。

1型糖尿?。煌庵苎?；T細(xì)胞抗原受體；結(jié)構(gòu)模擬

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）是一種常見自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前，研究普遍認(rèn)為T細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1-5]。隨著研究的深入，最近，人們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞抗原受體可能參與了T1D的發(fā)生[6]。文獻(xiàn)報道顯示，在24個TCR Vβ基因家族中，多數(shù)患者外周血優(yōu)勢表達(dá)Vβ7。據(jù)此，本研究擬利用熒光定量PCR熔解曲線分析技術(shù)檢測T1D患者外周血TCR Vβ7的克隆表達(dá)，并模擬分析其分子結(jié)構(gòu)，為探討T1D的發(fā)病機(jī)制提供研究支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩檢2例T1D患者為研究對象（T1D-1和T1D-2患者）。兩患者在參與本研究前6個月均未經(jīng)系統(tǒng)的抗免疫治療，未發(fā)現(xiàn)合并癥的臨床證據(jù)，均排除肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、梅毒螺旋體、結(jié)核桿菌等病原感染，以及腫瘤、自身免疫病和免疫缺陷病等。

1.2 方法

抽取2例T1D患者靜脈血2mL，經(jīng)密度梯度離心獲取淋巴細(xì)胞，按照前期研究方法[10]，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以RQ-PCR進(jìn)一步擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增曲線后，以熔解曲線分析技術(shù)進(jìn)行分析。然后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，利用IMGT數(shù)據(jù)庫，以生物信息學(xué)軟件CPH Models 2.0 Server和RasMol 2 Software進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬和分析。

2 結(jié)果

2.1 TCR Vβ7的序列分析

T1D-1患者TCR Vβ7的序列為“CASRTAGQYEQYFGPGTR”，T1D-2患者TCR Vβ7的序列為“CASRTAGQYEQFFGPGTR”。兩者的區(qū)別在于第十二個氨基酸，前者為酪氨酸（Y），而后者為苯丙氨酸（F），“TAGQYEQ”為兩患者TCR Vβ7共同擁有的氨基酸序列。見表1。

2.2 TCR Vβ7的結(jié)構(gòu)模擬

利用IMGT數(shù)據(jù)庫以及生物信息學(xué)軟件CPH Models 2.0 Server和RasMol 2 Software，我們分別模擬出兩患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)。見圖1～2。

在棍棒模式下，兩患者TCR Vβ7的結(jié)構(gòu)極為相似；而在球體模式下，兩者的不同能夠較為容易地觀察出來。根據(jù)TCR CDR與抗原肽結(jié)合的原理，沿著CDRs頂部結(jié)構(gòu)畫線可作為T1D抗原肽的一級結(jié)構(gòu)，然后將兩條抗原肽進(jìn)行復(fù)合處理，結(jié)果顯示彼此不能重合。見圖3。

表1 兩例T1D患者發(fā)生漂移的TCR Vβ7的基因序列

圖1 兩位T1D患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)模擬圖（棍棒模式）（A）T1D-1患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)模擬圖；（B）T1D-2患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)模擬圖

圖2 兩位T1D患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)模擬圖（球體模式）（A）T1D-1患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)模擬圖；（B）T1D-2患者TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)模擬圖

圖3 根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)模擬的T1D-1和T1D-2患者特異的TCR Vβ7特異抗原肽一級結(jié)構(gòu)圖A.T1D-1患者特異的TCR Vβ7特異抗原肽一級結(jié)構(gòu)圖；B.T1D-2患者特異的TCR Vβ7特異抗原肽一級結(jié)構(gòu)圖

3 討論

在關(guān)于TCR Vβ基因譜系漂移與T1D發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究中，TCR Vβ7是常發(fā)生優(yōu)勢克隆表達(dá)的基因。因此，有學(xué)者把TCR Vβ7的優(yōu)勢表達(dá)作為T1D患者外周血TCR譜系漂移的特異性變化[7-10]。在本研究中，兩位T1D患者的外周血均檢測到Vβ7的單克隆性漂移，并且這兩個來源于不同個體的基因擁有相同的氨基酸序列：TAGQYEQ。在一些文獻(xiàn)中，這種存在于不同基因家族或不同個體的相同基因家族稱為基因熔解譜序模式（gene melting spectral pattern， GMSP）[7，11，13]。Yang等[14]認(rèn)為這種含有GMSP的T細(xì)胞是針對疾病抗原的特異性T細(xì)胞克隆。這類含有特異TCR Vβ克隆的T細(xì)胞往往在對細(xì)菌、病毒及腫瘤等相關(guān)抗原識別和應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[11-12，15]。據(jù)此，本研究發(fā)現(xiàn)的克隆表達(dá)的Vβ7應(yīng)該是針對T1D的特異性克隆基因，該基因的優(yōu)勢克隆可能與T1D的發(fā)生相關(guān)。

利用IMGT數(shù)據(jù)庫以及生物信息學(xué)技術(shù)（CPH Models 2.0 Server and RasMol 2 Software），我們分別模擬出兩位T1D患者的TCR Vβ7的晶體結(jié)構(gòu)。在棍棒模式下，兩者的晶體結(jié)構(gòu)極為相似，難以辨別出差別。有趣的是，當(dāng)采用球體模式進(jìn)行模擬時，可以較容易發(fā)現(xiàn)它們之間的差異。由于TCR CDR3是識別和結(jié)合抗原肽的主要部位，所以我們在TCR的CDR及凹槽結(jié)構(gòu)上劃線，在一定程度上可以代表與TCR相對應(yīng)的抗原肽的一級結(jié)構(gòu)，將兩條“抗原肽”進(jìn)行重合試驗，結(jié)果彼此不能覆蓋，這暗示可能兩條抗原肽的組成或者結(jié)構(gòu)不同。由此，我們推測，對于多數(shù)T1D患者來說，即使TCR Vβ7都存在譜系漂移，或者更進(jìn)一步說，即使這些優(yōu)勢克隆表達(dá)的家族有著相似或相同的基因序列，引起這種克隆變化的抗原也有可能不同。在以前的報道中，研究者往往在同一疾病不同的患者發(fā)現(xiàn)了共同的GMSPs，就認(rèn)為可能是相同的抗原表位引起的TCR Vβ譜系漂移[11-12，16]。顯然，與本研究的發(fā)現(xiàn)不完全一致。在Takeuchi等[17]的研究報道中，認(rèn)為高表達(dá)的單克隆TCR Vβ家族不一定就是來源于同一反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，這與本研究的結(jié)果較為一致。在下一步的試驗中，我們將擴(kuò)大樣本量對此結(jié)果予以進(jìn)一步的研究和驗證。

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Analysis and simulation of TCR Vβ7 molecular structure of peripheral blood from two patients with type 1 diabetes

ZHOU Jianwei1JIA Yinfeng1WANG Li2KONG Cui3JIN Chengqiang1DONG Haixin1
1.Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Ji'ning Medical University, Ji'ning 272029, China; 2.Department of Pharmacology, the First People's Hospital of Ji'ning City, Ji'ning 272011, China;3. Department of Nursing, the Affiliated Hospital of Ji'ning Medical University, Ji'ning 272029, China

Objective To compare the sequences and crystal structures of TCR Vβ7 obtained from two patients with type 1 diabetes(T1D). Methods The skewness of TCR Vβ7 of two T1D patients were detected with realtime florescence quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) and DNA melting curve analysis technique followed by being sequenced, the crystal structures of them were simulated according to IMGT database, CPH Models 2.0 Server and RasMol 2 Software. Results The whole sequences of TCR Vβ7 of T1D patient-1 were“CASRTAGQYEQYFGPGTR”, that of patient-2 were “CASRTAGQYEQFFGPGTR”, the only difference between them lied on the twelfth amino acid. The crystal structures of Vβ7 of the two patients simulated with stick model were rather similar, while that with sphere model were obviously different. Conclusion Although sharing the similar or same gene sequences, the crystal structures of the TCR Vβ7 obtained from different T1D patients probably are different.

Type 1 diabetes; Peripheral blood; T cell receptor; Crystal structure

R392.6

A

2095-0616（2015）07-47-03

2015-01-16）

山東省自然科學(xué)基金（ZR2012HL29）；山東省高等學(xué)校科技計劃項目（J11LF18）；山東省濟(jì)寧市科技發(fā)展計劃項目（[2011]57）。