侯 瑞，白 潔，劉小沙，高會(huì)旺，趙陽國

（中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100）

海洋異養(yǎng)細(xì)菌是海洋物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中的重要組成部分［1］，是海洋生態(tài)系統(tǒng)有機(jī)質(zhì)的分解者以及重要的二次生產(chǎn)者［2］，在海洋中數(shù)量大、繁殖速度快、轉(zhuǎn)換效率高，生物量循環(huán)迅速，在海洋生態(tài)環(huán)境中占有重要地位［3］。海洋異養(yǎng)細(xì)菌生長也是海洋碳、氮、磷等元素的生物化學(xué)過程的重要環(huán)節(jié)［4－6］，其中異養(yǎng)細(xì)菌的生產(chǎn)會(huì)消耗海水中的溶解性有機(jī)碳DOC和營養(yǎng)鹽（無機(jī)氮DIN、磷酸鹽P）并轉(zhuǎn)換為自身的生物量，而細(xì)菌的呼吸會(huì)代謝自身產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化為CO2，它們之間的關(guān)系會(huì)決定異養(yǎng)細(xì)菌的轉(zhuǎn)換效率，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長［7］。因此，海水和營養(yǎng)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)是影響異養(yǎng)細(xì)菌生長的重要限制因子［8－9］。

南海是中國面積最大的海域，屬于貧營養(yǎng)海區(qū)，其表層水溫終年較高（25℃以上）［10］，葉綠素和初級(jí)生產(chǎn)力水平較低［11］。由于受海水營養(yǎng)的限制，南海異養(yǎng)浮游細(xì)菌出現(xiàn)數(shù)量較少、分布不均［12－14］。南海屬于陸間海，面臨著大氣沉降、近岸陸源輸入和船舶排放等外來營養(yǎng)源的影響［15］，這勢(shì)必對(duì)海洋異養(yǎng)細(xì)菌種群數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定的影響［9，16］。然而，對(duì)于南海異養(yǎng)浮游細(xì)菌與營養(yǎng)鹽關(guān)系的研究主要集中于南海北部上升流區(qū)域和珠江口及大陸架海區(qū)，發(fā)現(xiàn)南海北部上升流區(qū)域和珠江口區(qū)域異養(yǎng)細(xì)菌主要受磷限制，而大陸架海區(qū)異養(yǎng)細(xì)菌主要受DOC限制［12－13］，對(duì)南海南部異養(yǎng)浮游細(xì)菌的研究還要追溯到1986［17］和2009年［18］，主要是對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌分布的研究。南海南部海域的環(huán)境條件與南海北部類似，但是其還受不同內(nèi)部物理過程和外部河流輸入的影響［19］，所以進(jìn)行外源營養(yǎng)物對(duì)南海南部海域異養(yǎng)細(xì)菌生長代謝影響的研究具有著重要意義。

本研究于2012年8月利用現(xiàn)場觀測(cè)和模擬培養(yǎng)相結(jié)合的方法對(duì)南海南部兩個(gè)典型站位海水中異養(yǎng)浮游細(xì)菌生長的影響因素進(jìn)行了研究。通過單獨(dú)和聯(lián)合投加DOC和N、P等營養(yǎng)要素，觀察異養(yǎng)細(xì)菌生物量、細(xì)菌比生長速率和呼吸速率的響應(yīng)，研究南海貧營養(yǎng)鹽區(qū)域異養(yǎng)細(xì)菌生長的限制因子，探討外源營養(yǎng)物對(duì)細(xì)菌物質(zhì)轉(zhuǎn)換效率和異養(yǎng)細(xì)菌生態(tài)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 現(xiàn)場觀測(cè)、培養(yǎng)與樣品采集

在南海南部海域選取兩個(gè)有代表性的海盆區(qū)域站位S1站（112°39.140′E，6°36.052′N）和陸架區(qū)域S2站（111°16.647′E，10°29.709′N）進(jìn)行現(xiàn)場觀測(cè)和模擬培養(yǎng)（見圖1）。由船載自容式CTD（Seabird 25，USA）采集表層1m處海水，同時(shí)測(cè)定現(xiàn)場水溫、鹽度、pH和溶解氧（DO）。水樣采集后，部分樣品置于已加入多聚甲醛的10mL無菌螺口管中，用于細(xì)菌生物量的測(cè)定；部分水樣過濾后用于營養(yǎng)鹽、DOC測(cè)定；部分水樣立即用65μm的篩絹過濾以除去浮游動(dòng)物的攝食干擾，分裝于1.5L的無菌PET瓶中，裝滿水并加入外源營養(yǎng)物質(zhì)后用半透膜封口，防止外界干擾但可保持瓶內(nèi)外交換。將培養(yǎng)瓶置于甲板，在通過循環(huán)海水的恒溫條件下培養(yǎng)6d。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共設(shè)5組：1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)營養(yǎng)物添加組，其中C組為對(duì)照組、D組只添加DOC、DN組添加DOC和N、DP組添加DOC和P、DNP組同時(shí)添加DOC、N和P，每組均設(shè)3個(gè)平行。添加的DOC為葡萄糖、N為KNO3、P為KH2PO4，實(shí)驗(yàn)分組和添加營養(yǎng)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量見表1。分別在第0、1、2、3和第6天中午定時(shí)取各培養(yǎng)組的水樣用于細(xì)菌和環(huán)境因子的測(cè)定，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)瓶中的溫度、鹽度、pH和DO。每次均取平行樣。

圖1 南海采樣站位Fig.1 Sampling stations of South China Sea

表1 實(shí)驗(yàn)分組及營養(yǎng)物質(zhì)添加量Table 1 Ambient nutrient concentration /μmol·L－1

1.2 現(xiàn)場環(huán)境因子及營養(yǎng)鹽和DOC的測(cè)定

現(xiàn)場水溫、鹽度和pH等數(shù)據(jù)由CTD測(cè)得，溶解氧（DO）由WTW 500i便攜水質(zhì)分析儀測(cè)得。

DOC樣品用高溫燃燒氧化法由島津TOC-V型總有機(jī)碳測(cè)定儀測(cè)定［20］。

營養(yǎng)鹽測(cè)定使用BRAN＋LUEBBE AA3型營養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀進(jìn)行。N-N用次氯酸鈉氧化靛酚藍(lán)法［20］，N-N用銅—鎘柱還原后鹽酸萘乙二胺絡(luò)合顯色法，N-N用鹽酸萘乙二胺絡(luò)合顯色法［21］。

1.3 細(xì)菌活性的測(cè)定

1.3.1 細(xì)菌生物量 將細(xì)菌樣品過濾到0.22μm的核孔膜上，經(jīng)過DAPI染色后，用Leica全自動(dòng)熒光顯微鏡對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)［23］。用換算因子20fg C/cell將異養(yǎng)細(xì)菌豐度換算為以碳單位表示的細(xì)菌的生物量［1］。

1.3.2 細(xì)菌比生長速率 根據(jù)公式p＝（lnN2－lnN1）/T計(jì)算培養(yǎng)3d前后細(xì)菌比生長速率，其中N1和N2是培養(yǎng)時(shí)間T前后的細(xì)菌總數(shù)［24］。

1.3.3 細(xì)菌呼吸速率 參照Vazquez-Dom在2007年的方法，根據(jù)每一時(shí)段前后DO濃度的變化量并換算成C消耗量來計(jì)算1d前后和3d前后細(xì)菌的呼吸速率［25］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多因素方差分析（Multivariate Analysis of Variance），計(jì)算顯著差異性，其中sig.＜0.05代表結(jié)果在不同分組上的差異具備顯著性。

應(yīng)用SPSS17.0的Correlate程序計(jì)算分析不同指標(biāo)類型結(jié)果之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同站位的環(huán)境特征分析

本研究所在的S1站位于南海南部南沙群島南部區(qū)域，屬于貧營養(yǎng)程度大的海盆區(qū)域，受人為影響較??；S2站位于南海西南部近岸陸架區(qū)域，靠近湄公河河口區(qū)，附近航線比較集中，受人為影響較大。2個(gè)站位表層海水的水溫、鹽度、pH、營養(yǎng)鹽現(xiàn)場監(jiān)測(cè)結(jié)果見表1，可以看出2個(gè)站位均具有南海典型的高水溫、高鹽度、高pH、寡營養(yǎng)鹽特征，其DOC、DIN和磷酸鹽水平大致與Yuan在2011年在南海北部得到的數(shù)值（DOC 70μmol/L，DIN 4μmol/L，P0.1μmol/L）相近［12］。因?yàn)镾2站靠近湄公河河口區(qū)，鹽度和營養(yǎng)鹽稍低于S1站，而DOC則高于S1站。S1的N∶P比值為15.87，S2的N∶P比值為17.57，S1站的N∶P比值與Redfield比值接近［26］，S2站的N∶P比值高于S1站。S1站和S2站表層水體的異養(yǎng)細(xì)菌豐度分別為1.45×105和2.15×105cell/mL，均低于Yuan在南海北部貧營養(yǎng)鹽區(qū)域測(cè)得的表層海水異養(yǎng)細(xì)菌豐度值（6±1）×105cells/mL的結(jié)果［12］，說明南海南部異養(yǎng)細(xì)菌生長受到環(huán)境因子的限制高于北部海區(qū)。

2.2 異養(yǎng)細(xì)菌生物量及對(duì)外源營養(yǎng)物的響應(yīng)

2個(gè)站位表層海水異養(yǎng)細(xì)菌的生物量見圖2。在S1站，培養(yǎng)期間對(duì)照組細(xì)菌生物量一直呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)；而只添加DOC的D組，細(xì)菌生物量在培養(yǎng)1d內(nèi)即達(dá)到最大值0.090 5mg C/L，是培養(yǎng)前的3.12倍；在培養(yǎng)2d后開始迅速下降。同時(shí)添加DOC和N或DOC和P的DN組和DP組的細(xì)菌生物量增長較D組緩慢，1d后開始迅速增長，在培養(yǎng)2d后分別達(dá)到最大值0.086 7和0.098 8mg C/L，分別為對(duì)照組的3.22和3.68倍。同時(shí)添加DOC、N和P的DNP組細(xì)菌生物量上升較其他組緩慢，在2d開始迅速增長，在3d達(dá)到最大值0.166 0mg/L，是對(duì)照組的8.89倍。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的第6天，S1站DOC添加的D組異養(yǎng)細(xì)菌生物量較對(duì)照組有明顯增長（P＜0.05），DN組、DP組異養(yǎng)浮游細(xì)菌生物量大于D組但不明顯（P＞0.05），而DNP組細(xì)菌生物量則明顯大于D組（P＜0.05）；3種營養(yǎng)物聯(lián)合聯(lián)合添加使細(xì)菌生物量顯著增加的結(jié)果表明，在南海南部貧營養(yǎng)的S1站，細(xì)菌的生長除受DOC的限制外，受DOC、N和P等環(huán)境因子的聯(lián)合限制更為明顯。

在離岸相對(duì)較近的S2站，各實(shí)驗(yàn)組異養(yǎng)細(xì)菌生物量的變化規(guī)律與S1站有所不同，各組生物量均在1d后快速增長，并在2d后達(dá)到最大值，D組、DN組、DP組、DNP組分別為0.085 8、0.170 8、0.237 6、和0.185 4 mg/L，分別為對(duì)照組的1.29 倍、2.56倍、3.56倍和2.78倍。其中，DP組細(xì)菌生物量的最大值。S2站各組細(xì)菌生物量均在培養(yǎng)第3d后開始逐漸降低。添加DOC的D組異養(yǎng)細(xì)菌生物量與對(duì)照組的差異不顯著（P＞0.05），說明DOC對(duì)S2站異養(yǎng)細(xì)菌生長的限制不明顯；添加P組的生物量較對(duì)照組的顯著增大（P＜0.05），表明離岸較近的S2站細(xì)菌生物量受P的限制更為明顯。

表2 不同站位的現(xiàn)場環(huán)境因子及細(xì)菌測(cè)定結(jié)果Table 2 Initial environmental factor of the stations

圖2 不同營養(yǎng)物添加組細(xì)菌生物量的變化Fig.2 Variation of bacterial biomass among different treatments

2.3 異養(yǎng)細(xì)菌呼吸速率及對(duì)外源營養(yǎng)物的響應(yīng)

在培養(yǎng)期間的前3天內(nèi)，S1站和S2站不同組異養(yǎng)細(xì)菌呼吸速率的變化結(jié)果見圖3。在遠(yuǎn)海的S1站，培養(yǎng)期間對(duì)照組細(xì)菌呼吸速率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)；添加DOC的D組細(xì)菌呼吸速率在1d即有明顯升高并達(dá)到最高值，為1.035mg/L·d；DN、DP和DNP組的細(xì)菌呼吸速率則在培養(yǎng)期間一直呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，在第3天分別為對(duì)照組的3.44、3.02和4.01倍。

S2站的細(xì)菌呼吸速率與其細(xì)菌生物量的變化趨勢(shì)比較相似，其中DOC、DN組均在2d達(dá)到最大值，分別為0.818和1.155mg/L·d，為對(duì)照組的1.28倍和1.81倍，之后稍有下降。而DP組和DNP組的細(xì)菌呼吸速率在培養(yǎng)第3d達(dá)到最大值，分別為1.288和1.241mg/L·d，是對(duì)照組的2.01倍和3.06倍。

隨著營養(yǎng)物質(zhì)的增加，異養(yǎng)細(xì)菌的生長需要更多的能量進(jìn)行物質(zhì)合成，所以異養(yǎng)細(xì)菌的呼吸作用出現(xiàn)了增大的態(tài)勢(shì)［26］。在S1站，DOC對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌呼吸速率的促進(jìn)作用較為明顯（P＜0.05），并且在添加DOC的基礎(chǔ)上，聯(lián)合添加N、P對(duì)異養(yǎng)細(xì)菌呼吸速率的作促進(jìn)用更為顯著（P＜0.05）；氮的添加對(duì)細(xì)菌呼吸速率的促進(jìn)效果比磷的添加更為顯著（P＜0.05），同樣表明該海域細(xì)菌生長以DOC限制為主，同時(shí)可能受氮的限制。

在離岸相對(duì)較近的S2站，營養(yǎng)物質(zhì)添加對(duì)細(xì)菌呼吸速率的增加與S1有所不同，添加DOC組細(xì)菌呼吸效率的增長對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），聯(lián)合添加磷的DP組對(duì)細(xì)菌呼吸速率的促進(jìn)效果最為顯著（P＜0.05），進(jìn)一步表明該海域細(xì)菌活性受磷的限制更為明顯。

圖3 不同營養(yǎng)物添加組細(xì)菌呼吸速率的變化Fig.3 Variation of bacterial respiration rate among different treatments

2.4 異養(yǎng)細(xì)菌比生長速率及對(duì)外源營養(yǎng)物的響應(yīng)

不同組異養(yǎng)細(xì)菌在培養(yǎng)前3天的比生長速率見表3。在S1站，對(duì)照組在培養(yǎng)前3天異養(yǎng)細(xì)菌比生長速率為負(fù)值，說明不添加外源營養(yǎng)物質(zhì)，由于營養(yǎng)缺乏會(huì)導(dǎo)致異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在培養(yǎng)期間緩慢下降。而添加DOC的D組細(xì)菌比生長速率明顯大于對(duì)照組（P＜0.05），表明異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的增長受到了DOC的限制；Yuan等在2011年和Kirchman等在2000年也得出海洋異養(yǎng)細(xì)菌在近岸海域主要受DOC限制的結(jié)論［5，12］；DN組、DP組和DNP組的細(xì)菌比生長速率明顯大于D組（P＜0.05），且DN組的比生長速率明顯大于DP組（P＜0.05），而DNP組的細(xì)菌比生長速率最大，主要因?yàn)楫?dāng)環(huán)境中DOC限制緩解后，氮和磷會(huì)成為細(xì)菌生長的限制因子［29］，表明在S1站異養(yǎng)細(xì)菌的生長主要受DOC的限制，同時(shí)也存在氮的限制。

在S2站，D組前3天的比生長速率比對(duì)照組大但不顯著（P＞0.05），這與S2站環(huán)境中的DOC濃度較高有關(guān)。DN、DP和DNP組的比生長速率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），其中DP組細(xì)菌比生長速率較對(duì)照組的增長最為明顯，進(jìn)一步說明在S2站異養(yǎng)浮游細(xì)菌生長受磷的限制更為明顯。而DP組的細(xì)菌比生長速率大于DNP組；這可能是因?yàn)樵赟2站異養(yǎng)細(xì)菌是磷限制且浮游植物是氮限制的，同時(shí)加氮和磷會(huì)可能促進(jìn)浮游植物的生長并使其與異養(yǎng)細(xì)菌競爭其它營養(yǎng)物質(zhì)，一定程度上抑制了浮游細(xì)菌的生長［27］。

2.5 細(xì)菌生長效率及對(duì)外源營養(yǎng)物的響應(yīng)

Pradeep-Ram在2002年曾報(bào)道，海水中細(xì)菌的呼吸速率與細(xì)菌生產(chǎn)之間有著緊密的關(guān)系［24］。異養(yǎng)細(xì)菌的比生長速率與細(xì)菌呼吸速率的比值可作為細(xì)菌物質(zhì)轉(zhuǎn)換效率的指標(biāo)。通過對(duì)2個(gè)站位培養(yǎng)期間前3d的異養(yǎng)細(xì)菌比生長速率和呼吸速率進(jìn)行相關(guān)性分析，可見二者之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系（r＝0.896，P＜0.01）。2個(gè)站位比生長速率與細(xì)菌呼吸速率的比值見表3；比值越大，說明細(xì)菌對(duì)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換效率越高，細(xì)菌異養(yǎng)程度越高［28］。在不同實(shí)驗(yàn)組中，2個(gè)站位聯(lián)合添加DOC、氮和磷3種營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于細(xì)菌轉(zhuǎn)換效率的促進(jìn)作用最為明顯；此外，在S1站氮的添加對(duì)細(xì)菌轉(zhuǎn)換效率的促進(jìn)作大于磷，而在S2站則相反。

外源營養(yǎng)物質(zhì)在促使異養(yǎng)細(xì)菌生物量和呼吸速率增長的同時(shí)，使異養(yǎng)細(xì)菌的異養(yǎng)程度進(jìn)一步增大，也增加了細(xì)菌的物質(zhì)轉(zhuǎn)換效率，將有助于其在南海南部海域生態(tài)效率的提高。

表3 培養(yǎng)3d時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌比生長速率（p）、呼吸速率（r）及二者比值的（p/r）Table 3 Bacterial special growth rate and bacterial respiration rate

3 結(jié)論

（1）南海南部2個(gè)站位S1、S2都屬貧營養(yǎng)狀態(tài)，其異養(yǎng)細(xì)菌生物量相對(duì)于其他海域較低。在海盆區(qū)的S1站，異養(yǎng)細(xì)菌生長的主要限制因子是DOC，其次是氮限制；而在近岸的S2站，異養(yǎng)細(xì)菌則主要受磷限制。

（2）當(dāng)南海南部海域2個(gè)站位海水受外源營養(yǎng)物輸入時(shí)，異養(yǎng)細(xì)菌生物量和呼吸速率叫對(duì)照組明顯增高。在S1站，同時(shí)添加DOC、氮和磷時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌生物量、比生長速率和呼吸速率的增加最為顯著；而近岸的S2站，同時(shí)添加DOC和磷時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌生物量、比生長速率和呼吸速率增長最為顯著。外源營養(yǎng)物質(zhì)的添加使2個(gè)站位異養(yǎng)細(xì)菌的異養(yǎng)程度明顯增加，將異養(yǎng)細(xì)菌的物質(zhì)轉(zhuǎn)換效率明顯增加，顯著提高其在南海南部海域的生態(tài)作用效率和生態(tài)功能。

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