胡 鵬，劉新富，劉 濱，溫海深，楊 志，雷霽霖**

（1.中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東 青島 266071；3.煙臺開發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264000）

紅鰭東方鲀（Takifugurubripes）是中國北方海水養(yǎng)殖和出口創(chuàng)匯的重要魚類，養(yǎng)殖產(chǎn)量和產(chǎn)值最高達到8 000t和6億元［1］。近年來，隨著進口國日本、韓國市場的飽和以及養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高，中國紅鰭東方鲀出口創(chuàng)匯競爭力顯著下降，迫切需要改良品種和提升養(yǎng)殖技術以提高養(yǎng)殖效率和效益。紅鰭東方鲀的精巢是難得的珍貴食材，有“西施乳”的美譽，日本市場售價高達3 000～6 600日元/個［2］。因此，生產(chǎn)和養(yǎng)殖全雄紅鰭東方鲀，可以大幅度提高我國紅鰭東方鲀養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，增強產(chǎn)業(yè)國際競爭力。

紅鰭東方鲀雌雄異體，性別決定機制為雄性異配（XY型）［3］，生產(chǎn)全雄苗種的關鍵技術環(huán)節(jié)是制備“超雄魚”親魚（遺傳型為YY型）。紅鰭東方鲀卵粒大、卵黃多，采用雄核發(fā)育技術生產(chǎn)超雄魚難度很大，較為可行的途徑是利用“偽雌魚”（遺傳性別為XY的雌魚）與正常雄魚交配產(chǎn)生“超雄魚”［4－5］。而誘導“偽雌魚”需要在稚、幼魚性別分化這一性別可塑的關鍵“窗口期”，利用外源激素或者環(huán)境條件改變誘導基因型為XY的稚、幼魚性反轉(zhuǎn)為“偽雌魚”。紅鰭東方鲀性腺分化發(fā)生的時間節(jié)點就成為其全雄苗種制種的關鍵基礎生物學信息之一。

迄今為止，有關紅鰭東方鲀性腺分化的組織學研究僅有2篇文獻，所報道2個日本地理種群的性腺分化起始時間分別為40～50日齡［6］和50日齡［7］。參考這些結果，在20～80日齡對中國沿岸土著紅鰭東方鲀種群人工繁育后代進行性逆轉(zhuǎn)誘導，盡管17－α雌二醇口服用量較高（100～200μg/kg餌料），但是效果不理想，產(chǎn)生較高比例的間性性腺。為了摸清中國土著種群紅鰭東方鲀仔幼魚性腺分化的準確時間節(jié)點，以便指導偽雌魚誘導，為全雄苗種制種技術的開發(fā)奠定基礎，我們對山東日照沿海土著紅鰭東方鲀?nèi)斯し庇蟠男韵俜只^程進行了組織學研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2010 年春季捕撈自山東日照沿海的紅鰭東方鲀野生親魚，經(jīng)過1年的人工馴養(yǎng)和促熟培育，2011年4月采用LHRH-a催產(chǎn)，人工受精獲得受精卵。受精卵在17℃的水溫下孵化8～10d后，將孵出的初孵仔魚布池進行培育，培育水溫為18～23℃。仔魚孵化后3日齡開口，18日齡進入稚魚期，26日齡完成變態(tài)發(fā)育為幼魚，根據(jù)仔、稚和幼魚的生長情況，投喂輪蟲、鹵蟲無節(jié)幼體和配合飼料。

1.2 實驗方法

從孵化后2～40日齡，每2d取樣1次，40～117日齡，每7d取樣1次，每次取樣30～40尾（見表1）。取樣的仔、稚和幼魚，2～40日齡樣品采用Bouin’s液固定，40日齡以后的樣品采用Davison液固定。樣品固定24h，50%乙醇將固定液沖洗干凈，置于70%乙醇中，4℃低溫密封保存。

固定的樣品，采用電子游標卡尺測量樣品全長后，進行石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4～7μm），H.E染色，中性樹膠封片，OLYMPUS DP72顯微鏡進行觀察、測量和拍照。

表1 紅鰭東方鲀仔、稚、幼魚樣品的日齡、數(shù)量和全長Table 1 Age，number and total length of the samples of larvae，juveniles and young fish of Takifugu rubripes

2 結果

2.1 原始性腺的發(fā)育

孵化后2～10日齡，仔魚全長2.73～3.42mm（n＝8），在中腎管下方和腸管之間的體腔膜附近觀察到成對出現(xiàn)的原始生殖細胞（見圖1A）。原始生殖細胞呈圓形或橢圓形，直徑（長徑）7.18～7.84μm；細胞質(zhì)呈嗜弱酸性；細胞核大且透亮，核膜清晰，核仁明顯，直徑4.29～5.59μm。

孵化后12～16日齡，仔魚全長3.59～6.76mm（n＝6），一對原始性腺形成（見圖1B～C），此時的原始性腺只含有2～3個原始生殖細胞和少量的體細胞，原始生殖細胞多呈圓形，直徑6.23～7.26μm，細胞核直徑4.12～5.36μm。這段時期仍能觀察到有原始生殖細胞向原始性腺遷移（見圖1C），遷移中的原始生殖細胞呈橢圓形，長徑6.92～7.57μm，細胞核直徑4.24～5.28μm。

孵化后18～38日齡，稚、幼魚全長7.15～17.33mm（n＝9），這段時期未發(fā)現(xiàn)有原始生殖細胞繼續(xù)向原始性腺遷移，原始性腺內(nèi)生殖細胞3～5個（見圖1D～E），隨著個體的發(fā)育，體細胞數(shù)量增多，原始性腺體積逐漸增大，原始性腺從背部體壁游離出來，通過性腺系膜與其相連（見圖1E）。在此過程中，不同個體間原始性腺大小和生殖細胞數(shù)目無明顯差異。

2.2 卵巢的分化和發(fā)育

孵化后40～47日齡，幼魚全長18.06～27.33mm，原始性腺體積進一步增大，形態(tài)變化有2種趨向，其中一部分（n＝7）性腺形態(tài)特征與前一階段基本相同，另外一部分（n＝6）變化較大，兩葉性腺面向體腔側壁的一側上、下兩端體細胞開始增殖，向外突出，然后分別下彎和上彎相向生長，性腺面向體腔側壁的一側中部內(nèi)陷形成卵巢腔原基（見圖2A），此后兩端突起逐漸接近、融合，形成封閉的卵巢腔（見圖2B～C）。所觀察的樣品中，幼魚卵巢腔原基出現(xiàn)和腔體封閉的全長分別為18.06mm（40日齡）和25.26mm（47日齡）。在卵巢腔封閉的同時，卵原細胞也開始形成，細胞呈圓形，體積比原始生殖細胞小，直徑為5.29～5.99μm，細胞質(zhì)嗜弱堿性，細胞核直徑3.65～4.43μm（見圖2C）。

孵化后54～75日齡，幼魚全長32.48～48.48mm（n＝10），卵巢內(nèi)部產(chǎn)卵板開始形成，并逐步向卵巢腔內(nèi)延伸，同時卵原細胞沿產(chǎn)卵板外側邊緣分布，頻繁進行有絲分裂形成卵原細胞群（見圖2D）。

孵化后82日齡，幼魚全長55.42～64.37mm（n＝4），少量卵原細胞進入第一次減數(shù)分裂初期，發(fā)育成為初級卵母細胞（見圖2E）。此時初級卵母細胞呈卵圓形，體積略大于卵原細胞，細胞直徑6.45～7.40μm，細胞質(zhì)嗜堿性；細胞核明亮，直徑3.93～4.46μm。同時還觀察到少量初級卵母細胞發(fā)育至周邊仁期（n＝3），細胞體積明顯增大，直徑9.37～12.45μm；細胞核大且較亮，直徑4.85～7.23μm，核仁3～6個（見圖2F）。

圖1 孵化后2～38日齡（全長2.73～17.33mm）紅鰭東方鲀原始性腺發(fā)育Fig.1 Primary gonad development at 2～38dph（2.73～17.33mm TL）in Takifugu rubripes

圖2 孵化 后40～82日齡 （全 長18.06～64.37mm） 紅鰭 東方 鲀卵 巢分化Fig.2 Ovarian differentiation at 40～82dph（18.06～64.37mm）in Takifugu rubripes

2.3 精巢的分化和發(fā)育

孵化后47～54日齡，幼魚全長21.85～32.43mm（n＝9），沒有形成卵巢腔原基的原始性腺（見圖3A～B），性腺內(nèi)細胞數(shù)量增多，但主要以體細胞為主，隨著性腺中央體細胞的增殖，原始生殖細胞轉(zhuǎn)移至性腺邊緣（見圖3B），原始生殖細胞直徑5.85～6.89μm，細胞核直徑3.16～3.96μm。

孵化后61日齡，幼魚全長30.63～41.85mm（n＝5），在性腺柄部形成裂縫狀的輸精小管，原始生殖細胞發(fā)育形成精原細胞，精原細胞呈圓形或卵圓形，直徑5.37～6.04μm，中央有一圓形細胞核，直徑2.51～2.94μm（見圖3C）；性腺邊緣的精原細胞增殖旺盛，精原細胞體積變小，直徑3.84～4.25μm，細胞核直徑2.24～2.69μm。同源精原細胞聚集在一起，形成一囊狀結構，即精小囊（見圖3D）。

孵化后68～89日齡，幼魚全長42.85～67.42mm（n＝13），精巢邊緣的精原細胞不斷進行有絲分裂，精原細胞數(shù)目增加，精小囊數(shù)量增多，精巢逐漸增大（見圖3E）。

孵化后103日齡，幼魚全長74.64～88.62mm（n＝4），少量精原細胞進入減數(shù)分裂期，形成初級精母細胞；初級精母細胞比精原細胞小，細胞質(zhì)基本不著色，細胞核嗜堿性強，核染色深，核仁較小不明顯（見圖3F）。

圖3 孵化后47～103日齡（全長21.85～88.62mm）紅鰭東方鲀精巢分化Fig.3 Testis differentiation at 47～103dph（21.85～88.62mm TL）in Takifugu rubripes

3 討論

依據(jù)原始性腺向卵巢和精巢分化前是否經(jīng)過“類似卵巢結構”的過渡階段，可以將雌雄異體魚類的性腺分化方式分為直接分化和間接分化2種類型。已研究的魚類中，大多數(shù)雌雄異體魚類的性腺分化方式都屬于直接分化［8］，只有斑馬魚［9］和虎皮鲃［10］等少數(shù)魚類屬于間接分化。紅鰭東方鲀的卵巢和精巢，直接分化自幼魚期的原始性腺，中間沒有經(jīng)過“類似卵巢結構”的過渡性腺階段，其性腺分化方式與大多數(shù)魚類相似，屬于直接分化類型。

雌雄異體的硬骨魚類，種類不同，其性別分化過程差異較大，判斷其性別組織學分化起始時期的依據(jù)主要包括：1）原始性腺即將開始分化時所含生殖細胞的數(shù)目。有些魚類，如青鳉［11］和三刺魚［12］，向卵巢方向分化的原始性腺中生殖細胞數(shù)量比向精巢方向分化的要多。2）生殖細胞減數(shù)分裂的啟動。許多魚類生殖細胞減數(shù)分裂啟動的時期早于解剖學結構（如卵巢腔）的形成［13］。3）卵巢腔和輸精小管等解剖學特征的形成［14－17］。本研究的結果表明，紅鰭東方鲀性腺分化初期，原始性腺中的生殖細胞數(shù)量并沒有明顯的性別差異；卵巢腔在40日齡（全長18.06mm）時開始出現(xiàn)原基，至47日齡（全長25.26mm）時即分化完成，而輸精小管在61日齡（全長33.62mm）時出現(xiàn)，分別早于卵母細胞和精母細胞出現(xiàn)的時間（82和103日齡）。因此，采用卵巢腔（原基）和輸精小管的形成分別作為紅鰭東方鲀卵巢和精巢分化的標志比較合理。

與大多數(shù)魚類一樣，紅鰭東方鲀卵巢先于精巢開始分化，其開始分化的時期，本研究結果為孵化后40日齡（全長18mm左右），比2位日本學者確定的45日齡［6］和50日齡［7］要早。但是從全長來看，鈴木等的研究結果為18.26～23.61mm，松浦等雖然沒有給出幼魚全長，但是推測也在18mm左右，與我們的研究結果基本一致，中、日3個地理種群的卵巢分化開始時間沒有顯著差別。至于精巢開始分化的時間，依據(jù)輸精小管形成的時間，本研究確定為61日齡（全長33.62mm），2位日本學者研究分別為75日齡（缺乏全長數(shù)據(jù)）［6］和80日齡（全長58.26～77.36mm）［7］，分歧比較大，但是三者所觀察到的初級精母細胞出現(xiàn)時期非常一致（100日齡左右）。造成這些分歧的原因，可能是此階段（60～100日齡）紅鰭東方鲀雄魚的輸精小管等精巢特有結構比較細微，采用石蠟切片技術不容易觀察，而與地理種群的差異無關。

根據(jù)本研究的結果，中國沿海紅鰭東方鲀卵巢的分化時期為40～82日齡，精巢的分化時期為61～103日齡。因此，我們在此前的“偽雌魚”誘導試驗中，所選擇的誘導時期20～80日齡，只涵蓋了性腺分化的起點，但是沒有涵蓋精巢分化的終點，可能成為誘導結束后出現(xiàn)間性性腺的原因。另外，通常仔幼魚的性腺分化時期，與體長的關系比同日齡的關系更加密切［5，18－19］，選擇誘導時期的時候還需要考慮溫度等因素造成的生長差異，以及個體間的生長差異。

4 結語

中國土著紅鰭東方鲀?nèi)斯し庇蟠韵俚慕M織學分化過程與日本種群差別不大。孵化后2日齡（全長2.69mm）原始生殖細胞遷移至消化道背部和中腎管之間，孵化后12日齡（全長3.59mm）原始性腺形成；孵化后40～82日齡（全長18.06～55.42mm）卵巢分化，其起始和結束的標志分別為卵巢腔原基形成和初級卵母細胞出現(xiàn)；孵化后61～103日齡（全長33.62～67.45mm）精巢分化，其起始和結束的標志分別為輸精小管形成和初級精母細胞的出現(xiàn)。本文的研究結果為研究紅鰭東方鲀性別控制和全雄苗種制種技術奠定了基礎。

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