陶 蘋，余曉紅，劉 莉，王 瓊，齊亞娜，李 卉△，李佳圓

(1．四川省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，成都610041;2．成都市婦女兒童中心醫(yī)院體檢科，成都610041;3．成都市婦女兒童中心醫(yī)院婦女保健中心，成都610041;4．四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，成都610041)

人類正常乳腺組織雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)過(guò)度表達(dá)可能會(huì)增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。XbaⅠ(rs9340799)是人群研究較為關(guān)注的ERα基因多態(tài)性位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于ERα基因(人類染色體6q25．1)第1內(nèi)含子內(nèi)，于第2外顯子上游351bp處發(fā)生A→G(x→X)基因突變［1］。該突變可能會(huì)影響正常乳腺組織ERα基因某些區(qū)域外顯子的選擇性剪接，從而降低ERα蛋白的表達(dá)活性［2］。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的大豆異黃酮對(duì)正常乳腺組織ERα表達(dá)具有不同方向的調(diào)節(jié)作用［3-4］。本課題開展基因-環(huán)境交互作用研究，探討雌激素受體α基因XbaⅠ酶切片段多態(tài)性(簡(jiǎn)稱:XbaⅠ多態(tài)性)、膳食大豆攝入與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象

2010年7月至2012年6月序貫收集來(lái)源于四川省腫瘤醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)診斷的原發(fā)性乳腺癌新發(fā)病例。對(duì)照組來(lái)源于成都市婦女兒童醫(yī)學(xué)中心的健康體檢女性。病例對(duì)照年齡30～70歲，均居住于四川省10年以上者。病例排除轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，精神疾病及其它內(nèi)分泌疾病患者。對(duì)照排除放射線等職業(yè)暴露史、惡性腫瘤、內(nèi)分泌疾病、生殖系統(tǒng)疾病以及精神疾病患者。調(diào)查對(duì)象均簽署知情同意書。

1．2 研究方法

1．2．1 樣本量計(jì)算 樣本量計(jì)算采用QUANTO(1．2．4版)專用軟件(美國(guó)南加利福尼亞大學(xué)開發(fā))估計(jì)基因-環(huán)境交互作用樣本量，參數(shù)設(shè)定如下:(1)檢驗(yàn)水準(zhǔn)和檢驗(yàn)效能:雙側(cè)α=0．05，檢驗(yàn)效能為0．8;(2)等位基因頻率:參照文獻(xiàn)，漢族女性XbaⅠ野生等位基因攜帶率為71．1%［5］;(3)環(huán)境因素暴露率:根據(jù)課題組前期研究結(jié)果，膳食大豆高攝入比例約為45．5%［6］;(4)基因主效應(yīng)(G)、環(huán)境主效應(yīng)(E)及交互效應(yīng)(G-E):由于XbaⅠ人群研究結(jié)論尚不一致，采用ORg=1．0;根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，取 ORe=0．50［6］;交互效應(yīng) OReg在0．20～0．40間變化時(shí)，研究所需病例對(duì)照樣本量在124～281對(duì)之間變化。本次研究最終收集樣本量為病例對(duì)照各291例。

1．2．2 調(diào)查方法 現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采用問(wèn)卷收集研究對(duì)象一般人口學(xué)特征、女性月經(jīng)史、生育史、吸煙、飲酒、乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史等信息。采用頻數(shù)調(diào)查和單次攝入量調(diào)查結(jié)合的方法，調(diào)查研究對(duì)象最近五年的常見大豆類食物攝入情況。隨機(jī)抽取5%研究對(duì)象于調(diào)查兩周后重新進(jìn)行問(wèn)卷復(fù)核，兩次回答一致率為90%。

1．2．3 基因型檢測(cè) 基因型檢測(cè)采用EDTA抗凝管收集研究對(duì)象的外周靜脈血5ml，-20℃保存。采用天根生化科技(北京)有限公司全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)XbaⅠ(rs9340799)基因多態(tài)性。目的基因擴(kuò)增采用巢式 PCR技術(shù)，利用Primer Premier5．0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)PCR引物。外側(cè)引物:上游5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’;下游 5’-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTAT-CTGA-3’。內(nèi)側(cè)引物:上游5’-AGGCTGGGCTCAAACTACAG-3’，下游 5’-CTCTGGGAGATGCAGCAGAT-3’。采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司XbaⅠ內(nèi)切酶(1U/μl)對(duì)目的位點(diǎn)進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察酶切結(jié)果。如圖1所示，僅出現(xiàn)一條316bp條帶，為野生純合型(xx);存在615bp和316bp兩條帶，為突變雜合型(Xx);僅出現(xiàn)一條615bp條帶，為突變純合型(XX)。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行基因型重復(fù)檢測(cè)，重測(cè)結(jié)果一致率為100%。

圖1 XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)電泳圖

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2．1 乳腺癌危險(xiǎn)因素病例及對(duì)照組間比較

本研究病例組和對(duì)照組平均年齡分別為48．00±10．96 歲和47．64 ±8．90歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1．65，P＞0．05)。總?cè)巳杭敖^經(jīng)前后亞組危險(xiǎn)因素篩選結(jié)果詳見表1，總?cè)巳褐?，文化程度、家庭人均月收入、月?jīng)狀態(tài)、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、初潮年齡、初產(chǎn)年齡、活產(chǎn)次數(shù)、哺乳情況在病例及對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。絕經(jīng)前女性中，文化程度、家庭人均月收入、初潮年齡、初產(chǎn)年齡、活產(chǎn)次數(shù)、哺乳情況在組間分布差意義異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P＜0．05)。絕經(jīng)后女性中，文化程度、家庭人均月收入、BMI、初產(chǎn)年齡、活產(chǎn)次數(shù)、哺乳時(shí)間、是否服用雌激素存在組間分布差異(P ＜0．05)。

表1 乳腺癌常見危險(xiǎn)因素變量篩選結(jié)果

2．2 XbaⅠ多態(tài)性主效應(yīng)

總?cè)巳褐校瑢?duì)照組 x等位基因攜帶率為78．2%。對(duì)照組XbaⅠ位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(XbaⅠ:χ2=0．001，P=0．98)。在總?cè)巳骸⒔^經(jīng)前及絕經(jīng)后女性中，XbaⅠ基因型分布與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(Xx vs．xx:OR=0．61～0．82;XX vs．xx:OR=0．60～3．62;Xx+XX vs．xx:OR=0．61～0．92，95%CI均包括1)。見表2。

2．3 膳食大豆主效應(yīng)

總?cè)巳褐胁±MDISI攝入量中位數(shù)為7．36 mg/d(QU-QL=14．42 mg/d);對(duì)照組 DISI攝入量中位數(shù)為 9．62 mg/d(QU-QL=12．84 mg/d)?？?cè)巳汉徒^經(jīng)后人群中，DISI攝入量與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)(總?cè)巳?OR=0．64，95%CI:0．42～0．97;絕經(jīng)后:OR=0．40，95%CI:0．19～0．81)。但在絕經(jīng)前人群中未發(fā)現(xiàn)二者的關(guān)系。見表2。

表2 XbaⅠ多態(tài)性、膳食大豆攝入與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

表3 XbaⅠ多態(tài)性和膳食大豆攝入的聯(lián)合效應(yīng)

2．4 XbaⅠ多態(tài)性和膳食大豆的協(xié)同效應(yīng)

總?cè)巳褐?，與xx野生基因型相比，攜帶X突變等位基因的女性乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯變化;DISI高攝入組乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)有所降低(OR=0．60，95%CI:0．36～1．01);攜帶 X等位基因同時(shí) DISI高攝入女性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步降低(OR=0．47，95%CI:0．25～0．89)。相乘交互系數(shù) IOR 為1．15(0．49～2．76)。相加交互系數(shù) RERI為 0．19(-0．35～0．73)、API為 0．41(-0．75～1．57)、S 為0．73(0．34～1．59)見表 3。亞組分析未發(fā)現(xiàn) XbaⅠ多態(tài)性與膳食大豆的協(xié)同作用。

3 討論

雌激素受體XbaⅠ位點(diǎn)是人群研究較為關(guān)注的雌激素受體易感基因多態(tài)性位點(diǎn)。Maruyama等［2］的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攜帶x等位基因的ERα表達(dá)活性增高。但本研究尚未觀察到XbaⅠ多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。這與此前國(guó)內(nèi)外部分人群研究結(jié)論一致。但來(lái)自中國(guó)、韓國(guó)和挪威的人群研究發(fā)現(xiàn)攜帶X等位基因可降低乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)［5，11-12］。研究間結(jié)論不一致的原因可能與研究間樣本量差異、各研究人群代表性有關(guān)。但總的說(shuō)來(lái)，目前大部分研究報(bào)道的XbaⅠ的風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)較弱(OR＜2，OR 95%CI下限接近1)，說(shuō)明其對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)較小。

大豆異黃酮對(duì)ERα表達(dá)的調(diào)節(jié)比較復(fù)雜。Wood［3］等發(fā)現(xiàn)高劑量服用大豆異黃酮(240mg/d)的卵巢切除的雌性哺乳動(dòng)物，乳腺組織ERα活性標(biāo)記物pS2表達(dá)量明顯降低。但有體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮中主要成分之一染料木苷低濃度即可誘導(dǎo)人和嚙齒類動(dòng)物的上皮細(xì)胞ERα表達(dá)，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)［4］。本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)女性膳食大豆攝入對(duì)乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)呈保護(hù)作用，尤其在絕經(jīng)后女性中更為明顯。該研究結(jié)果與多項(xiàng)人群研究結(jié)論一致。最近一項(xiàng)大樣本Meta分析［13］顯示，亞洲女性膳食大豆攝入可明顯降低其乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)(合并OR=0．86，95%CI:0．77-0．95)，且對(duì)絕經(jīng)后女性具有更明顯的保護(hù)作用。

由于基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)XbaⅠ多態(tài)性、大豆異黃酮攝入可能會(huì)通過(guò)影響乳腺組織ERα表達(dá)水平從而影響乳腺細(xì)胞增殖，因此推測(cè)XbaⅠ多態(tài)性、膳食豆類攝入在影響乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)上可能存在共同的作用環(huán)節(jié)，進(jìn)而可能存在生物學(xué)交互作用。本研究采用分層分析估計(jì)XbaⅠ多態(tài)性、膳食大豆的統(tǒng)計(jì)學(xué)交互作用。結(jié)果顯示總?cè)巳褐校葦y帶X等位基因又膳食大豆高攝入的女性乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，其風(fēng)險(xiǎn)降低程度明顯低于僅X等位基因暴露組和僅膳食大豆高攝入組，這提示二者可能存在相乘模式下的交互作用，且作用模式符合超相乘作用(RR11＞RR01×RR10)。但 Logistic回歸顯示相乘交互作用系數(shù)IOR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究發(fā)現(xiàn)相加交互系數(shù)也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，根據(jù)本研究結(jié)果，尚不能認(rèn)為XbaⅠ多態(tài)性、膳食大豆攝入存在生物學(xué)交互作用。目前，關(guān)于XbaⅠ多態(tài)性、膳食豆類攝入對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)影響的機(jī)制研究尚不成熟，后續(xù)深入的機(jī)制研究將有助于理解兩者之間是否存在生物學(xué)交互效應(yīng)及效應(yīng)特點(diǎn)。此外，本次研究結(jié)果也不排除由于兩者交互作用歸因危險(xiǎn)度較小，且本次研究樣本量較局限，因此尚未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)交互效應(yīng)。后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討二者的交互作用。

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