曾志燎，溫暖玲，茹開卓，李瑜

（1.深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣東 深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 深圳 440300）

深圳地區(qū)救護(hù)野鳥中禽流感的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)

曾志燎1，溫暖玲2，茹開卓1，李瑜1

（1.深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣東 深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 深圳 440300）

為調(diào)查深圳地區(qū)救護(hù)野鳥中禽流感感染狀況，于2015年4月至2015年5月從深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心放養(yǎng)區(qū)采集了野鳥肛拭子77份、野鳥血清11份，利用RT-PCR方法對(duì)拭子樣品進(jìn)行了AIV抗原檢測(cè)；利用血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）對(duì)血清樣品進(jìn)行H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9等5種血清型AIV抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示：拭子樣品的AIV-Ag抗原檢測(cè)全部陰性；而血清樣品中H5（Re-4）陽性數(shù)1份，陽性率為1/11；H9陽性數(shù)1份，陽性率為1/11；未檢出H5（Re-6）、H5（Re-7）及H7陽性抗體。

野鳥；禽流感；抗原；抗體；檢測(cè)

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正粘病毒科A型流感病毒引起的-種急性、敗血性傳染病，幾乎所有野生鳥類及家養(yǎng)禽類均可感染。2005年，中國青海湖上千只候鳥相繼感染高致病性禽流感病毒死亡。令人關(guān)注的是2013年中國暴發(fā)的H7N9禽流感，其能感染人并導(dǎo)致人類死亡。新型H7N9禽流感病毒感染人類并導(dǎo)致高死亡率，可能源于候鳥攜帶病毒的變異。禽流感特別是高致病性禽流感已經(jīng)嚴(yán)重危及到人類健康，并有進(jìn)-步突破種間屏障形成人間流行的潛在可能。因此，需要深入了解野鳥中禽流感病毒的分布情況及其傳播規(guī)律，為高致病性禽流感的防控工作提供參考。

深圳位于中國重要的水鳥遷徙三大路線之一“東亞-澳大利亞飛行路線”上，每年9月份到次年5月份之間，吸引著數(shù)以十萬計(jì)的東半球國際候鳥遷徙途經(jīng)或留在深圳。據(jù)記載，在深圳棲息的野生鳥類以鷺、鷗、雁等為主，共有389種，占全國鳥類總數(shù)的近1/3，占全球鳥類的1/30。其中包括黑臉琵鷺等珍稀瀕危物種在內(nèi)的50多種國家重點(diǎn)保護(hù)鳥類。對(duì)于這些野生鳥類（包括侯鳥和留鳥），目前尚缺乏有效的免疫與疫病監(jiān)控措施。鑒于此，于2015年4月5月對(duì)深圳地區(qū)救護(hù)的野鳥進(jìn)行了禽流感的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，以期為有效控制或預(yù)防禽流感提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、熒光PCR檢測(cè)儀、微量加樣器、96孔V型微量反應(yīng)板、組織勻漿器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑75%乙醇；0.01 mol/L（pH 7.2）的PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）；H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；阿氏（Alsevers）液；雞紅細(xì)胞懸液；AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集2015年4～5月從深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心放養(yǎng)區(qū)采集野鳥肛拭子77份、野鳥血清11份（野鳥樣品詳細(xì)分類見表1）。

表1 野鳥樣品詳細(xì)分類

1.2.2樣品處理采集的鳥血樣采用受體破壞酶（RDE）去除待檢血清中的非特異性抑制素，將4容量的RDE加入1容量的血清中，37℃水浴16h～18h，然后56℃水浴50min（破壞殘余RDE的活性），4000r/min離心后取上清，再加入終濃度為100mL/L的測(cè)定用雞紅細(xì)胞懸液，搖勻，4℃過夜，1000r/min離心5min，取上清置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?；棉拭樣品置于含有抗菌素的pH 7.4～7.6Hanks液的采樣管內(nèi)。棉拭樣品及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室后，先將棉拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。然后用滅菌毛細(xì)吸管反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎黏液。置4℃待其自然沉淀5～10min，離心取上清備用。

1.2.3 血凝抑制試驗(yàn)HI試驗(yàn)參照GB/T 18936-2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》進(jìn)行。

1.2.4 H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法參照GB/T19438.2-2004《H5亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》、GB/T19438.3-2004《H7亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》和GB/T19438. 4-2004《H9亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 野鳥血清中AIV抗體HI試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)HI試驗(yàn)對(duì)不同亞型AIV抗H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9的檢測(cè)，在受檢的6種野鳥的11份血清中共檢出不同亞型AIV陽性抗體2份，陽性率為2/11。其中，H5（Re-4）陽性數(shù)1份，陽性率為1/11；H9陽性數(shù)1份，陽性率為1/11；未檢出H5（Re-6）、H5（Re-7）、H7陽性抗體。詳細(xì)結(jié)果見表2。2.2棉拭樣品AIV病毒的檢測(cè)結(jié)果采用熒光RT-PCR試驗(yàn)對(duì)野鳥的肛拭樣品進(jìn)行H5、H7和H9亞型AIV的病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

表2 AIV抗體HI檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 禽流感病毒抗原檢測(cè)2015年4～5月從深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心放養(yǎng)區(qū)采集野鳥肛拭子作病原學(xué)監(jiān)測(cè)，利用RT-PCR方法檢測(cè)H5、H7、和H9亞型禽流感病毒結(jié)果均為陰性，又經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查也未見發(fā)病癥狀的野鳥，分析其存在可能性有二種：一是H5、H7和H9亞型禽流感病毒在深圳野生動(dòng)物救護(hù)中心放養(yǎng)區(qū)鳥類中不存在該病毒的攜帶者，因此未見感染發(fā)病；二是有可能個(gè)別禽流感病毒攜帶者其感染處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，不向外排毒，因此檢不出陽性，這些有待作進(jìn)一步研究。

3.2 禽流感病毒血清抗體檢測(cè)2015年4～5月采集深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心放養(yǎng)區(qū)野鳥血清11份，利用HI試驗(yàn)對(duì)不同亞型AIV抗體{H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9}進(jìn)行檢測(cè)。其中1份紅綠金剛鸚鵡血清H5N1（Re-4）亞型AIV抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性，1份環(huán)頸雉血清H9亞型AIV抗體檢測(cè)結(jié)果為陽性。利用RT-PCR方法檢測(cè)相同個(gè)體紅綠金剛鸚鵡和環(huán)頸雉的肛拭子，H5和H9亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。分析紅綠金剛鸚鵡和環(huán)頸雉血清中檢測(cè)出AIV陽性抗體原因是：人工養(yǎng)殖環(huán)節(jié)接種過禽流感疫苗，因?yàn)樵摷t綠金剛鸚鵡是深圳海關(guān)查獲非法入境的野生動(dòng)物，環(huán)頸雉是森林公安查獲非法售賣的野生動(dòng)物，紅綠金剛鸚鵡在南美洲經(jīng)人工養(yǎng)殖出來的，并非在野外捕獲的；該環(huán)頸雉也是人工養(yǎng)殖的，而不是來自野外。

[1]王湘予，等.青海湖地區(qū)野禽禽流感監(jiān)測(cè)與分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（7）：20-22．

[2]Chen H，et a1.Avian Flu：H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl[J].Nature，2005,436：191-192．

[3]Grund CH，et al.Avian paramyxovirus serotype 1 isolates from the spina cord of parrots display a very low virul ence[J].Journal of Veterinary Medicine Series B Aims and Scope.2002.

[4]Grund CH，et al.Avian paramyxovirus serotype 1 isolates from the spina cord of parrots display a very low virul ence[J].Journal of Veterinary Medicine Series B Aims and Scope.2002.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．10.011

曾志燎（1985～），廣東省河源市人，本科，獸醫(yī)師，從事工作野生動(dòng)物救護(hù)及野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)等工作