張喜庫 劉桐輝

吉化集團公司總醫(yī)院藥劑科，吉林吉林 132022

冬蟲夏草特異性PCR鑒定方法研究

張喜庫 劉桐輝

吉化集團公司總醫(yī)院藥劑科，吉林吉林 132022

目的 建立一種準確、簡便的方法鑒別冬蟲夏草真?zhèn)巍?方法 采用改良CTAB法從冬蟲夏草樣品中提取總DNA，根據(jù)rDNA中ITS1區(qū)序列設計一對特異性引物，對蟲草樣品進行特異性擴增。 結果 冬蟲夏草標準品和部分市售蟲草樣品能擴增出255bp大小的目的片段，其余蟲草樣品未能擴增出相應條帶。 結論改良CTAB法提取DNA所需時間短對DNA分子破壞性小。特異PCR鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚姆椒蚀_快捷，對珍貴藥材的甄別具有廣闊的前景。

冬蟲夏草；改良CTAB法；PCR

本品為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體[1]，俗稱蟲草。其主要產(chǎn)于西藏、青海、云南、四川等高海拔地區(qū)，以豐滿肥大，外色黃亮，內(nèi)部色白者為佳[2-3]?！侗静輩残隆分杏涊d冬蟲夏草性溫味甘，具有補虛損、益精氣、化痰止咳的功效，與人參、鹿茸齊名并譽為中國的三大補藥[4-5]。中醫(yī)常用于久咳虛喘，產(chǎn)后虛弱、陽痿陰冷等“虛”的病癥[5-6]，是我國名貴的中藥材。蟲草所含化學成分豐富，特別是蟲草多糖，可通過影響細胞的增殖、分化及分泌，提高細胞免疫和體液免疫功能，增強人體免疫力，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[7-10]。蟲草中的蛋白質(zhì)、氨基酸以及30余種微量元素是改善心腦血管功能、降低血糖的必要成分[7-13]。由于冬蟲夏草功效獨特，且人工撫育技術尚未成熟，原材料供不應求，市場上也常常出現(xiàn)人工偽制蟲草以次充好的現(xiàn)象，致使藥源市場上魚龍混雜、真假難辨。因此，準確鑒別冬蟲夏草的真?zhèn)尉哂惺种匾囊饬x。本文借鑒前人對冬蟲夏草的研究，建立了一種快速簡便、準確靈敏的鑒別方法，為蟲草的甄別提供新的科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

冬蟲夏草標準品（中國食品藥品檢定研究，批號201103）；蛹蟲草（吉林省食品藥品檢驗所鑒定）；人工偽制蟲草（吉林省食品藥品檢驗所鑒定）；待測樣品購于吉林市各大藥店。

1.2主要化學試劑

2×CTAB[2% CTAB 2g，1.4mol/L NaCl 8.18g，20mmol/L EDTA 0.74g，0.1mol/L Tris-Hcl（pH 8.0）10mL，0.3% β-巰基乙醇 0.2mL]、dNTPs（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）、10×PCR Buffer（北京天根生化科技有限公司）、Taq 酶（北京天根生化科技有限公司）、10×Loading Buffer（北京天根生化科技有限公司）、DNA Ladder （北京天根生化科技有限公司），瓊脂糖凝膠粉（England），PCR引物由生工生物（上海）有限公司合成。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純，無菌雙蒸水（自制）。

1.3儀器

H-2050R型臺式低溫高速離心機（美國Becman公司）；梯度PCR熱循環(huán)儀（鄭州博邦科貿(mào)有限公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；紫外分光光度計（上海分析儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（濟南德瑞克儀器有限公司）；-20℃冰箱（北京福意電器有限公司）。

2　方法

2.1樣品前處理[14]

取冬蟲夏草干品用雙蒸水刷凈，浸于75%的酒精中1min，37℃烘干后，放入研缽中研磨成粉。

2.2模板DNA的提取[15-17]

稱取冬蟲夏草粉末0.1g置于離心管中， 加入預熱后2×CTAB 300μL混勻，65℃水浴振蕩2h。4 ℃下，10000r/min離心10 min，吸取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）抽提1次。加入等體積預冷的異丙醇，-20℃放置1h。10000r/min離心10min，棄上清液。沉淀物用適量70% 乙醇洗滌，10000r/min離心5min，棄上清液。室溫干燥沉淀，加入80μL TE溶液溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3DNA的純度、濃度檢測[18]

將DNA模板液適當稀釋后，用紫外分光光度計測定260、280nm處各樣品的吸光度A260和A280，以A260/A280 的比值計算DNA的純度及濃度。

2.4特異性引物設計及PCR擴增反應

從GenBank中查尋冬蟲夏草的DNA序列（KC437356），通過Premier 5.0設計特異引物，并對設計的引物進行評估[19-20]，最終確定特異性引物序列（上游引物：5’GAGCATCGTACGTACCAT 3’,下游引物：3’CGCTCGTACCTGAATA 5’），送由上海生工完成引物合成。

PCR反應體系為30μL[21]：10×PCR buffer（含Mg2+） 3.0μL，dNTPs（2.5mmol/L） 2.4μL，上、下游引物各1μL，Tap DNA聚合酶（5U/μL） 1μL，2μLDNA模板（100ng/μL）。

PCR擴增條件為[22]：94℃預變性5min，94℃變性30sec，56℃退火45sec，72℃延伸50sec，35個循環(huán)后72℃延伸10min。

2.5PCR產(chǎn)物檢測[19]

PCR產(chǎn)物與10×Loading buffer（10∶1）溶液混勻點樣于2%瓊脂糖凝膠板上，電壓75V，電泳40min，經(jīng)紫外檢測拍照。

3　結果與分析

3.1DNA純度及濃度檢測結果

CTAB法提取樣板DNA的純度在（1.80±0.23）之間，見表1。結果表明：改良CTAB法提取的DNA樣品純度高、無蛋白質(zhì)污染。

表1　冬蟲夏草及待測樣品的純度和濃度檢測結果

3.2PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

經(jīng)PCR特異性擴增后，僅冬蟲夏草標準品、市售蟲草3號與引物存在特異性結合位點，可在255bp處擴增出亮度不同的陽性條帶。蛹蟲草、人工偽制蟲草均無相應條帶出現(xiàn)，市售蟲草樣品1、2、4號也無擴增條帶，且空白對照無污染，見圖1。結果表明：除冬蟲夏草標準品與市售蟲草3號為正品外，其余皆為偽品冬蟲夏草，此實驗結果與吉林省藥檢所鑒定結果相同。

圖1　冬蟲夏草樣品PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

4　討論

冬蟲夏草中富含較多的蛋白質(zhì)、多酚、脂類等干擾DNA提取的物質(zhì)。常規(guī)CTAB法所獲得的DNA模板中除蛋白質(zhì)含量較高外，還會混有多酚氧化的褐色物等，難以獲得高純度的DNA，從而影響到后續(xù)試驗（如酶切， PCR擴增反應等）的進行。作者總結前人經(jīng)驗，對常規(guī)CTAB法進行了如下改進：（1）由于蟲草樣品多為干品，因此適當增加β-巰基乙醇的用量，可減少組織的褐變；（2）在CTAB 緩沖液中加入EDTA和異丙醇，可沉淀大量雜質(zhì)，提高DNA 的純度；（3）將氯仿-異戊醇（24∶1）抽提減少為1次，減少了有毒化學試劑對人體的傷害和對環(huán)境污染，同時也簡化操作步驟，大大節(jié)省了實驗時間。改良CTAB法提取DNA純度在1.67～1.89之間，減少了蛋白質(zhì)對DNA模板的污染，為接下來的聚合酶鏈式反應提供了保障。

選擇適宜的退火溫度可以提高擴增反應的特異性，獲得理想的條帶。若退火溫度過低，引物可與非特定靶位點結合，產(chǎn)生非目的DNA片段，出現(xiàn)假陽性；若退火溫度過高，擴增結果的特異性會很強，但同時也會影響引物與模板的結合，導致擴增效率大大降低。經(jīng)過反復摸索，當退火溫度為56℃時，得到的條帶最為穩(wěn)定，特異性最強。因此，本實驗選定退火溫度為56℃。

實驗表明，本實驗所建立的方法特異性強、靈敏度高、操作簡單、所需樣品量少，由于本方法利用蟲草DNA的序列特征，從分子水平上鑒別蟲草的真?zhèn)?，具有很高的準確性和很強的通用性。此次試驗只選用吉林地區(qū)的市售蟲草作為樣品，日后打算擴展研究樣品數(shù)量，采集各地區(qū)的市售蟲草進行實驗，進一步驗證此方法的準確性。

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Studies on identification method by PCR of specificity of aweto

ZHANG Xiku LIU Tonghui
Department of Pharmacy, General Hospital of Jihua Group Corporation, Jilin 132022, China

Objective To establish an accurate and convenient method to identify aweto. Methods The modified CTAB method was used to extract genomic DNA from samples of the aweto. These samples were specifically amplified by a pair of specific primers which was designed according to ITS1 sequence of rDNA. Results 255bp target fragment could be amplified by the standard aweto and parts of samples of commercial aweto while other samples couldn't. Conclusion Modified CTAB method is a good way to extract DNA from aweto with shorter time and less destructive effects on DNA molecular. Specific PCR method is accurate and fast in the identification of aweto, which has wide prospects in identification of precious herbs.

Aweto; Modified CTAB method; PCR

R282.5

B

2095-0616（2015）09-55-03

（2015-03-04）