吳 靜王 琳凌 晨祁松楠趙瑞珂顧國(guó)浩▲

1.江蘇省鹽城市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城 224002；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215006

圍絕經(jīng)期婦女PD-1的表達(dá)及意義

吳 靜1王 琳2凌 晨2祁松楠2趙瑞珂2顧國(guó)浩2▲

1.江蘇省鹽城市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城 224002；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215006

目的 探討圍絕經(jīng)期婦女外周血單個(gè)核細(xì)胞共刺激分子PD-1mRNA和T細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)和意義。 方法 采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)70例圍絕經(jīng)期、40例絕經(jīng)后期和30例育齡期組外周血單個(gè)核細(xì)胞PD-1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 PD-1mRNA的表達(dá)在三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與育齡期組相比，圍絕經(jīng)期組及絕經(jīng)后期組PD-1mRNA表達(dá)量均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)在三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的PD-1水平低于育齡期組（P＜0.05）。 結(jié)論 共刺激分子PD-1的異常表達(dá)可能與圍絕經(jīng)期婦女免疫功能失調(diào)有關(guān)。

圍絕經(jīng)期；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；流式細(xì)胞術(shù)；免疫功能；PD-1

在大多數(shù)婦女老齡化的進(jìn)程中，圍絕經(jīng)期是一個(gè)必經(jīng)的重要時(shí)期。圍絕經(jīng)期是指從接近絕經(jīng)出現(xiàn)與絕經(jīng)有關(guān)的內(nèi)分泌、生物學(xué)和臨床特征起至最后1次月經(jīng)后1年內(nèi)的時(shí)期。處于圍絕經(jīng)期的婦女由于卵巢功能衰退，神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)均會(huì)出現(xiàn)紊亂而引起一系列相應(yīng)的臨床癥狀，如出現(xiàn)潮熱、出汗、情緒不穩(wěn)定、心悸、胸悶、失眠等癥狀。目前的臨床研究多集中于圍絕經(jīng)期婦女相關(guān)激素水平的研究，對(duì)該期婦女的免疫功能方面的研究相對(duì)較少。共刺激信號(hào)對(duì)于機(jī)體維持免疫功能穩(wěn)態(tài)具有重要作用，程序性死亡受體1（programmeddeath1，PD-1）是一種重要的共刺激分子，為CD28超家族成員，與其相應(yīng)的配體結(jié)合后發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。本課題選取了與免疫功能相關(guān)的重要分子PD-1，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其在T細(xì)胞表面的表達(dá)。從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平探討圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期婦女免疫功能的變化。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2013年6月～2014年1月于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院及鹽城市婦幼保健院高級(jí)體檢中心體檢的140例健康婦女血清，年齡19～73歲。其中，圍絕經(jīng)期組70例，平均年齡（42.5±3.6）歲，入選標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)月經(jīng)不規(guī)律現(xiàn)象到停經(jīng)1年內(nèi)的婦女；絕經(jīng)后期組40例，平均年齡（53±7.3）歲，入選標(biāo)準(zhǔn)為停經(jīng)1年以上的婦女；育齡期組30例，平均年齡（34.4±6.8）歲，入選標(biāo)準(zhǔn)為月經(jīng)周期正常的育齡期女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有肝、腎等內(nèi)科疾病者；（2）有免疫系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；（3）有婦科器質(zhì)性病變或曾行卵巢切除術(shù)者；（4）服用激素類藥物及半年內(nèi)有外科手術(shù)史者；（5）2周內(nèi)曾患急性感染性疾病者。

表1　PCR引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.2主要儀器及試劑

Trizol試劑（Ambion公司），F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液（上海恒信試劑公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根公司），RealMaster Mix試劑盒（天根公司），eppendorf—centrifuge 5430R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)eppendof公司），GeneAmp PCR System9700擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）、LightCycler 480Ⅱ擴(kuò)增儀（Roche公司），Thermo Spectronic紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Spectronic），鼠抗人CD3-FITC熒光素標(biāo)記單克隆抗體，鼠抗人CD8-Pe-CY7熒光素標(biāo)記單克隆抗體，鼠抗人PD-1-PE熒光素標(biāo)記單克隆抗體，溶血?jiǎng)ㄈ苎亍谜麴s水=1∶9），IgG-PE同型對(duì)照，溶血?jiǎng)ㄈ苎亍谜麴s水=1∶9）（單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司），流式細(xì)胞儀FACSC Calibur型（美國(guó)BD公司）。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本收集 月經(jīng)周期規(guī)則者于周期3天抽血，已絕經(jīng)者可隨時(shí)抽血，所有研究對(duì)象均于清晨空腹時(shí)抽取靜脈血5mL，乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）抗凝備用。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 取Ficoll淋巴細(xì)胞分離液3mL于試管中，吸取稀釋好的外周血沿管壁緩緩加入淋巴細(xì)胞分離液中，水平離心機(jī)2000rpm離心20min，吸取中間層云霧狀單個(gè)核細(xì)胞1.5mL于離心管中，10000rpm離心1.5min，棄上清，加入1mL生理鹽水混勻，10000rpm離心1.5min，棄上清，加RNAisoRegent混勻，于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3總RNA提取 加入200μL氯仿，猛烈顛倒混勻20次，冰浴5min，低溫離心機(jī)4℃，12000rpm離心6min，取上清至1.5mLEP管中，加入異丙醇500μL顛倒混勻，冰浴5min，低溫離心機(jī)4℃，12000rpm離心6min，棄上清，加入1000μL75%乙醇（0.1%DEPC水配制）混勻，低溫離心機(jī)4℃，12000rpm離心5min。棄去上清后倒置室溫干燥15min，加20μL 0.1%DEPC水溶解。1∶50稀釋提取的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)在260nm、280nm處光密度值（OD值），比值在1.8～2.0之間，說(shuō)明完整性良好。

1.3.4逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系（40μL）：Rnase Free ddH2O 19μL，Reverse Transcriptase M-MLV（200u/μL）1μL，5×Reverse Tanscriptase M-MLV Buffer8ul，dNTP Mixture（10mM）2μL，Random 9 mers（200u/μL）4μL，RNAsafe（20×）2μL，Total RNA 4μL。將上述 反應(yīng)體系 混勻，于GeneAmp PCR System9700擴(kuò)增儀上42℃ 60min，95℃ 5min，4℃ 1min進(jìn)行反應(yīng)，合成的cDNA保存于-80℃冰箱備用。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)品制備 采用本室制備的β-actin質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為3.34×108、3.34×107、3.34×106、3.34×105、3.34×104copies/mL。

1.3.6引物與探針設(shè)計(jì)及合成 引物與探針均由上海閃晶生物技術(shù)研究所設(shè)計(jì)并合成，見(jiàn)表1。

1.3.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 將逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA、陰性對(duì)照、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用LightCycler 480 Ⅱ擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25μL）：ddH2O 10μL，2.5×realMasterMix 10μL，正向引物（5pmol/μL）1μL，反向引物（5pmol/μL）1μL，探針（5pmol/μL）1μL，20×Probe Ehancer solution 1μL，模版1μL。設(shè)置循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性1min；94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 1min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。根據(jù)空白對(duì)照調(diào)整擴(kuò)增基線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的基因表達(dá)量。采用相對(duì)定量法，用內(nèi)參基因β-actin將目的基因PD-1校正至108copies/mL，取校正后目的基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為最終有效數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表面分子的表達(dá) 將EDTA-Na2抗凝外周血混勻備用，每個(gè)樣本準(zhǔn)備2個(gè)流式管，每管加入50μL的全血，2個(gè)流式管中依次加入20μL CD3/CD8/PD-1和CD3/CD8/IgG-PE同型對(duì)照管，振蕩混勻，室溫避光孵育15min，加入1mL溶血?jiǎng)?，振蕩混勻，室溫避光孵?2min，加入1mL的PBS，振蕩混勻，1500rpm/min離心5min，棄上清，加入300μL PBS，重懸細(xì)胞，上機(jī)分別測(cè)定CD4+、CD8+和CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。

1.3.9外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的檢測(cè) 使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞絕對(duì)值（×109/L），淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)值與流式細(xì)胞獲得的PD-1表達(dá)率相乘得到PD-1分子的表達(dá)量（×106/L）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)法，正態(tài)分布資料以表示，非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示；組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　研究對(duì)象外周血T表面共刺激分子PD-1表達(dá)量[或M（P25～P75）]

表2　研究對(duì)象外周血T表面共刺激分子PD-1表達(dá)量[或M（P25～P75）]

注：與育齡期組比較，aP＜0.05

圍絕經(jīng)期組　　絕經(jīng)后期組　　育齡期組　　統(tǒng)計(jì)量　P CD4+PD-1+（%）　8.96±4.9a　8.95±1.76a　12.69±2.21　10.99　　＜0.05 CD4+PD-1+（×106/L）　140.98（97.89～209.65）a168.23（120.21～196.89）a　248.56（211.32～295.65）　38.65　?。?.05 CD8+PD-1+（%）　6.24±3.28a　5.44±1.50a　7.17±2.02　19.99　　＜0.05 CD8+PD-1+（×106/L）　121.23±50.32a　104.01±35.21a　150.23±65.23　9.65　?。?.05

2　結(jié)果

2.1圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期婦女外周血單個(gè)核細(xì)胞表面共刺激分子PD-1 mRNA表達(dá)

PD-1mRNA的表達(dá)在三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圍絕經(jīng)期組PD-1 mRNA的表達(dá)量為（5.07±0.88），絕經(jīng)后期組PD-1 mRNA的表達(dá)量為（5.46±0.68），育齡期組PD-1 mRNA的表達(dá)量（4.43±0.89），與育齡期組相比，圍絕經(jīng)期組及絕經(jīng)后期組PD-1mRNA表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期婦女外周血T細(xì)胞表面共刺激分子PD-1的表達(dá)量分析

外周血T細(xì)胞表面PD-1分子相對(duì)表達(dá)率（%）和絕對(duì)值（×106/L）在三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD4+T細(xì)胞PD-1相對(duì)表達(dá)率（%）和絕對(duì)值（×106/L）在圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期均低于育齡期組（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞的PD-1的相對(duì)表達(dá)率（%）和絕對(duì)值（×106/L）在圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期均低于育齡期組（P＜0.05）。見(jiàn)表2，圖2。

圖1　圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)后期和育齡期組PD-1 mRNA表達(dá)比較

圖2　圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)后期和育齡期組T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量比較

3　討論

圍絕經(jīng)期（perimenopausal period）是指婦女從臨床上或血中激素水平開(kāi)始出現(xiàn)卵巢功能衰退的征兆至最后1次月經(jīng)后1年的時(shí)期[1]。圍絕經(jīng)期的平均年齡段在45～55歲之間，約持續(xù)5年左右，近年來(lái)有提前的趨勢(shì)，圍絕經(jīng)期以卵巢功能衰退，雌激素水平降低為主要特征，可伴隨出現(xiàn)一系列退行性改變?nèi)缭陆?jīng)紊亂、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、生殖道腫瘤等。雌激素受體可分布于女性多個(gè)部位組織和器官的細(xì)胞膜上，雌激素水平低下使這些組織和器官發(fā)生退行性變，引起心腦血管系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等的功能紊亂。胸腺是人體重要的中樞免疫器官，胸腺的萎縮直接影響機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，同時(shí)對(duì)體液免疫也有一定影響[2]。PD-1是一種重要的免疫抑制分子，為CD28超家族成員，PD-1與其相應(yīng)的配體結(jié)合可參與如病毒感染，自身免疫性疾病，腫瘤等多種病理進(jìn)程[3-5]。以PD-1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等有重要的意義。近年來(lái)，通過(guò)阻斷PD-1信號(hào)通路來(lái)治療各種腫瘤的研究也取得了很大的進(jìn)展[6-11]，顯示了PD-1在機(jī)體免疫功能研究中不容忽視的地位。

PD-1分子其與配體PD-L1結(jié)合能產(chǎn)生負(fù)向刺激信號(hào)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能受到抑制，增殖、活化及分泌細(xì)胞因子能力降低[11]。在許多慢性病毒感染中，PD-1/PD-L1發(fā)揮著很重要的作用，有研究發(fā)現(xiàn)患者在抗病毒治療前CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1顯著高于治療后和健康對(duì)照組[12]，表明PD-1分子與機(jī)體免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。本研究以PD-1分子為出發(fā)點(diǎn)，著重研究外周血單個(gè)核細(xì)胞PD-1mRNA的表達(dá)及T細(xì)胞表面PD-1分子的表達(dá)，從不同層面探討其變化與婦女圍絕經(jīng)期的關(guān)系。本次研究中發(fā)現(xiàn)：圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期婦女PD-1mRNA表達(dá)顯著升高，因此我們推測(cè)絕經(jīng)后婦女T淋巴細(xì)胞功能受到抑制，并可能導(dǎo)致免疫功能紊亂。但是我們發(fā)現(xiàn)：圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期婦女T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量顯著低于育齡期組，這與mRNA的表達(dá)結(jié)果不一致，推測(cè)該分子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)不同，這為進(jìn)一步研究PD-1的表達(dá)機(jī)制提供了一定的線索。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)：多發(fā)性硬化癥小鼠模型經(jīng)雌激素治療后T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)存在劑量效應(yīng)關(guān)系， 提示雌激素可能通過(guò)上調(diào)T細(xì)胞PD-1的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制功能[13]。有研究顯示[14]，胸腺細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞上均存在性激素受體，性激素通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮作用。由于絕經(jīng)期婦女雌激素水平降低，與T細(xì)胞表面的雌激素受體結(jié)合能力也隨之減弱，導(dǎo)致CD4+PD-1+、CD8+PD-1+的表達(dá)量下降。由此我們推測(cè)，圍絕經(jīng)婦女雌激素水平下降對(duì)PD-1可產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期女性存在內(nèi)分泌激素和細(xì)胞免疫功能的紊亂、外周血共刺激分子PD-1表達(dá)異常與其免疫功能紊亂可能存在一定的聯(lián)系。同時(shí)，共刺激分子的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄階段與翻譯階段存在一定的差異，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究探索。

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The expression and significance of PD-1 inperimenopausal and postmenopausal women

WU Jing1WANG Lin2LING Chen2QI Songnan2ZHAO Ruike2GU Guohao2
1.Department of Clinical Laboratory,Maternal and Child Health Hospital,Yancheng 224002,China;2.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective To investigate the expression of PD-1 mRNA in peripheral blood mononuclear cells and the expression of PD-1 on T cells in perimenopausal and postmenopausal women. Methods The mRNA expression of PD-1 mRNA were detected by Taqman probe real-time quantitative PCR,and the levels of PD-1 on T cells were determined by Flow Cytometry.The subjects in the study included 70 perimenopausal women,40 postmenopausal women and 30 childbearing age women. Results The expression ofPD-1 mRNA differed significantly in these three group(P＜ 0.05),compared with the childbearing age group,PD-1 mRNA level in postmenopausal women and postmenopausal women was significantly increased(P＜0.05);The expression ofPD-1 on T cells differed significantly in these three group(P＜0.05),compared with the childbearing age group,PD-1 level in postmenopausal women and postmenopausal women was significantly decreased(P＜0.05). Conclusion The abnormal expression of PD-1 may be closely related to the immune dysfunction of perimenopausal women.

Perimenopausal women;Real-time quantitative PCR;Flow Cytometry;Immune function;PD-1

R711.51

A

2095-0616（2015）09-13-05

▲

（2015-02-05）