康華 田亞瓊 張磊 王宇凡 劉樹業(yè)

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）系 流行性惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)引起癌癥死亡的第五大常見原因［1］，全球每年約有 59.8萬人死于HCC。我國HCC是位列第二的癌癥“殺手”，每年死亡人數(shù)占世界HCC死亡人數(shù)的一半以上［2，3］，其5年生存率僅為5%～6%，80%以上的HCC患者就診時(shí)已屬晚期，無法手術(shù)切除，即使可以手術(shù)切除，2年復(fù)發(fā)率依然高達(dá)50%，嚴(yán)重影響治療效果。因此，HCC的早期診斷尤為重要。目前，血清甲胎蛋白（alpha－fetoprotein，AFP）檢測和肝臟超聲檢查是檢測和篩查HCC的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而，這些方法的靈敏度和特異性均不高。蛋白質(zhì)組學(xué)是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)界高度活躍的研究領(lǐng)域之一［4］。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成功篩選出一些在 HCC 組織［5，6］、細(xì)胞［7］、血清［8，9］中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的蛋白標(biāo)志物，用于肝臟疾病的診斷和預(yù)后判斷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些新的藥物治療靶點(diǎn)，為肝臟疾病的診斷和治療帶來了新的機(jī)遇。本文研究采用胰蛋白酶酶解HCC患者血清蛋白質(zhì)，并以強(qiáng)陽離子交換與反相C18二維一體色譜柱對多肽液進(jìn)行分離并進(jìn)行質(zhì)譜檢測，鑒定并篩選HBV相關(guān)性HCC特異血清蛋白標(biāo)志物，為該病的診斷及治療提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年3月至2014年6月在我院肝膽外科進(jìn)行根治性手術(shù)切除的HBV相關(guān)性HCC患者20例。所有患者均經(jīng)病理組織切片診斷為HCC，按照巴塞羅那肝癌臨床分期均為Stage A1期，術(shù)前均未接受過任何抗腫瘤治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為HCC患者；②術(shù)前未接受化療或放療等抗腫瘤治療；③無內(nèi)分泌疾病和代謝性疾??；④肝、腎功能、血常規(guī)正常，水電解質(zhì)酸堿維持平衡；⑤無嚴(yán)重感染并均未用胃腸外營養(yǎng)（HCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2011年衛(wèi)計(jì)委頒發(fā)原發(fā)性肝癌診療規(guī)范）。同期選取30例健康志愿者、20例慢性乙肝患者、20例HBV肝硬化患者（均為Child pugh A級(jí)）作為對照組。所有血液標(biāo)本的采集和臨床資料收集均取得患者本人及家屬知情同意，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 抽取研究對象清晨空腹外周靜脈血5 ml置于分離膠促凝管中，3500 g離心30 min后取血清于－80℃保存待測。

1.3 儀器與試劑 Surveyor納升級(jí)高效液相色譜儀及LTQOrbitrap XL超高分辨生物質(zhì)譜儀均購自美國 Thermo Fisher Scientific公司；乙腈（HPLC 純）、甲酸（HPLC純）、丙酮（HPLC純）均購置于德國默克公司；蒸餾水經(jīng) Milli－Q 系統(tǒng)（Millipore Co.，USA）過濾后使用，低溫高速離心機(jī)（Thermo Fisher，USA），恒溫水浴箱（Thermo Fisher，USA），反相 C18 毛細(xì)管色譜柱及強(qiáng)陽離子交換與反相C18二維一體毛細(xì)管色譜柱購置于北京譜之源生物科技有限公司，10KDa超濾管（Millipore，USA），REAX control振蕩器（Heidolph，GER）、勻質(zhì)器（Silentcrusher，USA），耐受性噴針（New Objective，USA）。質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶（Trypsin）購置于美國Promega公司，二維一體色譜柱及專用pH梯度洗脫緩沖液均購置于北京華利世生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣本預(yù)處理 1）血清與丙酮按體積比為1∶4混合，4℃放置12 h后10 000 g離心30 min，棄上清取蛋白沉淀；2）蛋白沉淀加細(xì)胞裂解液溶解；3）將2）中所述蛋白溶液以非干擾性蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度；4）等蛋白質(zhì)量提取2）中所述蛋白溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)固定化修飾處理；5）3 KDa超濾管超濾，12 000 g離心1 h，留取膜上蛋白；6）用碳酸氫銨溶液反復(fù)吹吸膜上蛋白，每次200μl，吸至新的Ep管中；7）以質(zhì)量比1∶100加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，37 ℃水浴 18 h；8）10 kDa超濾管超濾，12 000g離心1 h，留取膜下肽段；9）凍干制成干粉冷凍保存直至上機(jī)分析；10）以pH＝2.5洗脫緩沖液溶解干粉，取100μl上機(jī)檢測。

1.4.2 樣本分析 色譜條件：液相色譜為Thermo Fisher公司的Surveyor納升級(jí)高效液相色譜系統(tǒng)，該系統(tǒng)備有二元溶劑梯度洗脫系統(tǒng)及自動(dòng)上樣系統(tǒng)。色譜柱為納升級(jí)強(qiáng)陽離子交換與C18反相二維一體色譜柱。色譜洗脫方式為pH梯度結(jié)合二元溶劑梯度洗脫，血清樣本分離pH梯度為pH＝2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8 十階 pH 梯度，每階 pH 梯度經(jīng)120 min水與乙腈二元溶劑梯度洗脫，二元溶劑流動(dòng)相為 A相0.1%甲酸水溶液，B相0.1%甲酸乙腈溶液，每階pH值洗脫過程為120 min，進(jìn)樣量為10 μl，流速設(shè)定在 200 μl／min（分流后進(jìn)入質(zhì)譜檢測，實(shí)際流量為200 nl／min），自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)定在4℃，柱溫設(shè)定在20℃。起始梯度為5%B維持20 min，至70 min B線性增加至35%，隨后在20 min內(nèi)將B快速增加至90%，保持90%B相5 min后迅速將B降至5%，維持5%B 25 min以平衡色譜柱。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜為Thermo公司的LTQOrbitrap XL系統(tǒng)，配有nano電噴霧離子源（ESI），正離子模式下進(jìn)行檢測。其條件為：毛細(xì)管電壓8 V、錐孔電壓100 V、離子源電壓2.4 kV；數(shù)據(jù)采集范圍m／z 400～1800；采用棒狀（centroid）模式掃描，分辨率為60 000。二級(jí)質(zhì)譜檢測采取線性離子阱動(dòng)態(tài)排除掃描模式，Orbitrap一級(jí)全掃配合10個(gè)最強(qiáng)信號(hào)的LTQ二級(jí)掃描，20 s內(nèi)出現(xiàn)相同質(zhì)荷比信號(hào)進(jìn)行二級(jí)掃描動(dòng)態(tài)排除，二級(jí)掃描碎裂模式為碰撞誘導(dǎo)解離（CID）模式，碰撞氣為高純氦氣（99.99%He），碰撞標(biāo)準(zhǔn)化能量控制在35%。質(zhì)量軸校正使用廠家提供的校正液（包括咖啡因、Ultramark 1621及tetrapeptide MRFA）。樣品分析的先后順序由Excel自帶函數(shù)隨機(jī)產(chǎn)生。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 本研究以 Thermo Fisher公司出品基于Sequest原理的Proteome Discovery軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定及相對表達(dá)含量分析。蛋白質(zhì)鑒定過程人類全蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫由國際蛋白質(zhì)索引（International Protein Index）提供。鑒定過程基本參數(shù)設(shè)定為：一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)荷比偏差低于10 ppm，二級(jí)質(zhì)譜檢測質(zhì)荷比偏差低于0.8 Da。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各對照組與HCC組蛋白質(zhì)相對表達(dá)量比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超高分辨質(zhì)譜儀檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Proteome Discovery軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，在各組血清樣本中共鑒定出3578種蛋白質(zhì)，對比所有檢出蛋白質(zhì)在各組中的相對表達(dá)量，從中篩選出7種在HBV相關(guān)性HCC組與其他對照組中相對表達(dá)量有顯著差異的蛋白質(zhì)，分別為富組氨酸糖蛋白（histidinerich glycoprotein，HRG）、血紅蛋白β亞基、血紅蛋白α 亞基、銅藍(lán)蛋白（ceruloplasmi，CP）、α－1B－糖蛋白（alpha－1B－glycoprotein，A1BG）、 抗凝血酶Ⅲ（antithrombin－Ⅲ，ATⅢ）和AFP。圖A、圖B為健康志愿者與HBV相關(guān)性HCC患者的血清多肽液總離子流圖（TIC）。

2.2 各組中7種蛋白相對表達(dá)量檢測結(jié)果比較蛋白相對表達(dá)量以離子阱質(zhì)譜動(dòng)態(tài)排除掃描過程檢測到的特異性肽段個(gè)數(shù)表示。HBV相關(guān)性HCC組與HBV肝硬化組相比，A1BG及AFP相對表達(dá)量增加，ATⅢ相對表達(dá)量減少；與慢性乙肝組相比，CP及AFP相對表達(dá)量增加，血紅蛋白α亞基相對表達(dá)量減少；與健康對照組相比，AFP相對表達(dá)量增加，HRG及血紅蛋白β亞基相對表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表1。

3 討論

表1 各組中7種蛋白相對表達(dá)量檢測結(jié)果比較（±s，個(gè)）

表1 各組中7種蛋白相對表達(dá)量檢測結(jié)果比較（±s，個(gè)）

注：＊1與健康對照組比較，Z＝－2.47，P＝0.012；＊2與健康對照組比較，Z＝－2.47，P＝0.012；＊3與慢性乙肝組比較，Z＝－3.00，P＝0.001；＊4與慢性乙肝組比較，Z＝－2.33，P＝0.019；＊5與HBV 肝硬化組比較，Z＝－2.20，P＝0.029；＊6與HBV 肝硬化組比較，Z＝－2.47，P＝0.012；＊7與其他三組比較，Z均＝－3.00，P均＝0.001

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HRG是位于第3號(hào)染色體上的抑癌基因，相對分子質(zhì)量為67～75×103，為一單鏈α2血漿糖蛋白。大多數(shù)HRG在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成，儲(chǔ)存于血小板的α顆粒中，受凝血酶啟動(dòng)釋放［10］。此蛋白有調(diào)節(jié)纖維蛋白生成、抑制可溶性免疫復(fù)合物形成、極化M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化、清除凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞、抗異常血管新生、抑制腫瘤生長和具有抗菌活性等作用［11］。Liu 等［12］認(rèn)為血液 HRG 水平可作為診斷早期HCC的分子標(biāo)志物。HRG表達(dá)降低會(huì)減少巨噬細(xì)胞極化及血管正?；厔?，降低機(jī)體對腫瘤的抑制及抗轉(zhuǎn)移能力。本文研究結(jié)果顯示，HRG在HBV相關(guān)性HCC患者中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是由于肝細(xì)胞受損影響HRG的分泌［13］。對于HBV相關(guān)肝臟腫瘤疾病，其發(fā)生發(fā)展過程均伴隨不同程度的肝細(xì)胞損害，因此對于該蛋白應(yīng)作進(jìn)一步的研究，探尋其腫瘤標(biāo)志性的同時(shí)分析其與肝細(xì)胞損害之間的關(guān)系。

人體內(nèi)的血紅蛋白由四個(gè)亞基構(gòu)成，分別為兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基。本文研究中發(fā)現(xiàn)血紅蛋白α亞基和血紅蛋白β亞基在HBV相關(guān)性HCC組中均成下調(diào)趨勢。有研究［14］顯示，血紅蛋白β亞基在應(yīng)激性潰瘍、腺瘤性息肉和結(jié)直腸癌等非肝臟疾病患者的血清中表達(dá)呈上調(diào)趨勢，在HCC、肝纖維化患者及HepG2細(xì)胞中均呈表達(dá)下降趨勢，與本文研究結(jié)果相符。由此可見，對該蛋白進(jìn)行深入研究有利于肝臟腫瘤的鑒別診斷。

圖A 健康志愿者血清肽段總離子流圖

圖B HBV相關(guān)性HCC患者血清肽段總離子流圖

CP又名銅氧化酶，是一種含銅的α2糖蛋白，是細(xì)胞色素氧化酶的組分。CP的生理功能包括參與銅轉(zhuǎn)運(yùn)和鐵代謝、抗氧化、參與急性期反應(yīng)。另外有研究［15］表明CP可作為腫瘤標(biāo)志物。本文研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)性HCC組CP表達(dá)水平顯著增加，原因是CP具有AFP特性，肝細(xì)胞發(fā)生惡性變化時(shí)，細(xì)胞的癌基因被啟動(dòng)，使肝細(xì)胞合成CP的能力增強(qiáng)，以致其含量在HCC患者體內(nèi)明顯增高。臨床上對于CP的檢測技術(shù)已經(jīng)相對成熟，本文研究結(jié)果提示CP配合AFP進(jìn)行肝臟腫瘤診斷具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)給予高度重視。本文研究結(jié)果顯示AFP在HBV相關(guān)性HCC組中呈特異性高表達(dá)，進(jìn)一步印證了其作為肝臟腫瘤臨床診斷標(biāo)志物的高度靈敏性。AFP依然是目前HCC定性診斷的最佳標(biāo)志物，對HCC的確診、預(yù)后推測、療效判斷及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測均具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值［16］。

A1BG是在血液樣本中發(fā)現(xiàn)的功能有待進(jìn)一步探索的蛋白質(zhì)，屬于免疫球蛋白家族，其在正常成人血漿中濃度為22 mg／dL［17］，但生物學(xué)功能尚未明確。A1BG在急性心梗、子宮內(nèi)膜異位癥、肺癌及糖尿病等疾病中均呈現(xiàn)表達(dá)差異。本文研究結(jié)果顯示，與HBV肝硬化組比較，HBV相關(guān)性HCC組血清A1BG表達(dá)上調(diào)，但其參與致癌作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

ATⅢ由肝臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成，是抗凝血系統(tǒng)的重要組成部分。Bechmann等［18］研究發(fā)現(xiàn)抗因子Xa活性與肝臟疾病的嚴(yán)重性呈負(fù)相關(guān)，和ATⅢ水平呈正相關(guān)，抗凝血酶本身與肝臟疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。Saray等［19］通過對慢性病毒性肝炎、早期肝硬化、代償性肝硬化以及失代償性肝硬化患者的蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ATⅢ水平在代償性肝硬化和失代償性肝硬化組中下降，ATⅢ和蛋白C與慢性肝臟疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)系數(shù)分別為r＝－0.931，r＝0.789（P＜均 0.01）。本文研究發(fā)現(xiàn)，HBV 相關(guān)性HCC患者血清ATⅢ表達(dá)水平下調(diào)。肝癌患者ATⅢ降低的主要原因是肝癌患者嚴(yán)重肝損害導(dǎo)致其獲得性合成減少，同時(shí)也與肝癌患者癌組織崩解、壞死，釋放促凝物質(zhì)、破壞凝血及纖溶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)系。

綜上所述，本文研究找尋的7種HCC血清蛋白標(biāo)志物全部由肝臟合成，與肝癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。雖然單個(gè)血清標(biāo)志物的檢測沒有肝癌特異性，但是多個(gè)蛋白標(biāo)志物聯(lián)合檢測配合蛋白標(biāo)志物指紋圖譜變化水平可以做為肝癌診斷的依據(jù)。

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