劉龍梅 王仲朝 李保 趙克斌

030001 太原市，山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科（趙克斌）

冠心病發(fā)病年齡男性≤55歲，女性≤65歲，稱為早發(fā)冠心?。╬remature coronary artery disease，PCAD）［1］。目前的臨床資料大多數(shù)是以中老年人作為研究對象，而對年輕人冠心病研究資料相對較少，而PCAD對患者危害更大。PCAD患者的臨床癥狀不典型，起病非常急，主要表現(xiàn)為急性冠狀動脈綜合征，尤其是急性心肌梗死，臨床病死率極高。

冠心病本為衰老相關性疾病，但是近年來發(fā)病越來越年輕化，當日歷年齡不能準確反映人體內(nèi)細胞老化狀態(tài)時，我們選取代表細胞老化的重要生物學指標—端粒作為研究對象。端粒被認為是真核細胞的“生命時鐘”［2］，短的端粒表現(xiàn)出更大的生物學年齡，其比日歷年齡更能準確地反映衰老與冠心病的相關性。

由于端粒長度調(diào)節(jié)具有非組織特異性，且有研究［3］證實，人外周血白細胞端粒長度和動脈粥樣硬化組織端粒長度之間具有相關性，為更方便的獲得臨床標本，本文研究選取人外周血白細胞端粒長度作為檢測指標，以探討端粒長度與PCAD發(fā)生、發(fā)展的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2013年12月我院經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心病的30例住院患者為PCAD組。入選標準：①經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心?。粗辽儆幸恢а塥M窄超過50%）。②冠心病發(fā)病年齡男性≤55歲，女性≤65歲。其中男性20例，女性10例，所有患者按年齡分為38～42歲組8例，43～50歲組10例，51～55歲組12例。同期選取我院健康體檢者30例為對照組，由于端粒長度與年齡、性別相關，本文研究對兩組性別、年齡進行配對，配對的年齡相差在2歲以內(nèi)。對照組性別比例及各年齡段人數(shù)均與PCAD組相同。所有血液標本的采集和臨床資料的收集均取得患者本人及家屬知情同意，并經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 標本采集 采集受試者靜脈血3～5 ml置于含有0.5 mol／L EDTA抗凝劑的離心管中，于－20℃冷凍保存待測。

1.3 儀器與試劑 羅氏公司端粒長度檢測試劑盒TeloTAGGG Telomere Length Assa；Amersham 公 司HyBond N＋帶正電荷尼龍膜；TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒。TaKaRa公司TP600型梯度PCR儀；BIO－RAD公司TY2795型電泳儀及491型電泳槽，GelDocXR型凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.4 方法

1.4.1 血液基因組DNA提取及鑒定 根據(jù)DNA提取試劑盒操作說明書提取樣本DNA，選取OD260／OD280值介于 1.8～2.0 之間 DNA 提取樣本作為實驗樣品。0.8%瓊脂糖凝膠電泳后紫外線下觀察DNA的完整性，對基因組進行酶切，37℃消化2 h，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切結(jié)果。酶切結(jié)果良好的樣品在電泳圖譜中DNA從上到下不出現(xiàn)主條帶，基因組酶切結(jié)果電泳圖譜見圖1。

1.4.2 southern blot檢測 將制備好的樣品進行0.7%的瓊脂糖凝膠電泳，80 V 恒壓、低溫、4 h，然后轉(zhuǎn)膜，雜交，洗膜，信號檢測，X線片經(jīng)積分光密度掃描，采用端粒長度分析軟件（Telomeric 1.2，http：／／www.gnu.org）計算端粒限制性片段（terminal restrict fragment，TRF）平均長度，其公式為TRF＝∑（ODi－background）／∑（ODi－background／Li）Li為 i點 marker長度，ODi為 i點的光密度值，background 為背景［4］。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSSl5.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組間計量資料的比較采用配對t檢驗，多組間計量資料的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 基因組酶切結(jié)果電泳圖譜

2 結(jié)果

2.1 PCAD組與對照組外周血白細胞端粒長度檢測結(jié)果比較 PCAD組外周血白細胞端粒長度明顯比對照組短，且差異有統(tǒng)計學意義（t＝2.162，P＝0.039），見表1，圖2。

表1 PCAD組與對照組外周血白細胞端粒長度檢測結(jié)果比較（±s，kb）

表1 PCAD組與對照組外周血白細胞端粒長度檢測結(jié)果比較（±s，kb）

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2.2 不同年齡段PCAD患者外周血白細胞端粒長度檢測結(jié)果比較 三個不同年齡段組PCAD患者外周血白細胞端粒長度差異有統(tǒng)計學意義（F＝4.380，P＝0.020）。43～50 歲組和51～55 歲組 PCAD 患者外周血白細胞端粒長度均長于38～42歲組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＝0.030，P＝0.020）；43～50 歲組和51～55歲組PCAD患者間外周血白細胞端粒長度差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.090），見表2。

3 討論

端粒是位于真核染色體末端的特異性DNA蛋白結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)特征為由（G＋C）的重復序列組成，其對維持染色體穩(wěn)定性、基因完整性及細胞增殖能力很重要。隨著細胞的分裂增殖，染色體的末端會出現(xiàn)復制、丟失，細胞每分裂1次，端粒DNA縮短50～150個堿基對，當端粒縮短到臨界長度時，染色體發(fā)生融合等變化，細胞喪失增殖能力。所以端粒長度從一定意義上來說可以反映細胞的分裂能力。健康人端粒的縮短大致與年齡呈負相關，即隨著年齡增長，端粒的長度是逐漸縮短的，但是在PCAD患者中，端粒長度縮短的速度顯然大于年齡的增長速度。PCAD的危險因素有很多，如吸煙、飲酒、血脂異常、陽性家族史等［5］，但近年來，PCAD的發(fā)病更傾向于用遺傳易感性來解釋。Samani等［6］的研究結(jié)果表明，冠心病患者加速的細胞衰老可能由端?？s短表現(xiàn)出來。端粒長度的變化貫穿于心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，并對心血管疾病的預后產(chǎn)生影響?？s短的端粒，作為遺傳因素的介入點，對最終內(nèi)皮功能失調(diào)導致動脈粥樣硬化，進而對冠心病形成起了橋梁的作用。本文研究發(fā)現(xiàn)，PCAD患者外周血白細胞端粒長度較對照組明顯縮短，這與我們之前的關于冠心病患者端粒長度的研究［7］結(jié)果相符，也與國外大多數(shù)研究［8］結(jié)果類似。

本文研究結(jié)果顯示，不同年齡段組PCAD患者間外周血白細胞端粒長度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），尤其值得關注的是，38～42 歲組 PCAD 患者的外周血白細胞端粒長度明顯短于51～55歲組及43～50歲組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。臨床資料顯示，本文研究中8例38～42歲組的PCAD患者均為ST段抬高急性心肌梗死發(fā)作收入院的急診病例。由于端粒自身的特點，富含鳥嘌呤，更容易受氧化刺激而出現(xiàn)加速縮短。本組如此低年齡的PCAD患者，是由于不良生活習慣導致的體內(nèi)氧自由基堆積過多而消耗了端粒，還是因為端粒的個體差異較大，即遺傳因素影響，還不得而知，尚需收集大量45歲以下病例進行進一步詳細的臨床研究。

在過去的十年中，端粒在心血管疾病中的研究已取得了很多成果，最近一項新的前瞻性研究［9］結(jié)果提示，端粒損耗與心血管疾病發(fā)生風險密切相關，并且不受年齡、性別和血管危險因素的影響，盡管如此，是否選取端粒檢測作為冠心病易感人群的分子指標大規(guī)模用于臨床，國內(nèi)外醫(yī)學界尚無定論，還需要大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)及區(qū)域性精細化數(shù)據(jù)來完善。

圖2 southern blot法檢測端粒長度電泳圖譜

表2 不同年齡段PCAD患者外周血白細胞端粒長度檢測結(jié)果比較（±s，kb）

表2 不同年齡段PCAD患者外周血白細胞端粒長度檢測結(jié)果比較（±s，kb）

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1 中華心血管病雜志編輯部血脂異常對策專題委員會.血脂異常防治建議.中華心血管病雜志，1997，25：169－175.

2 張嵩，王玉虎.端粒、端粒酶及其與腫瘤關系的研究進展.中國綜合臨床，2007，23：285－286.

3 陳宇，劉繼斌，劉鵬，等.人頸動脈粥樣硬化斑塊組織及外周血白細胞相對端粒長度的檢測及相關性分析.中國分子心臟病學雜志，2012，12：27－31.

4 HarIey CB，F(xiàn)utcher AB，Greider CW.TeIomereshorten duringageing of human fibrobIasts.Nature，1990，345：458.

5 王鵬，葉忠.早發(fā)冠心病的現(xiàn)狀及其高危因素分析研究.中國醫(yī)藥導刊，2011，13：2181－2182.

6 Samani NJ，Boultby R，Butler R，etal.Telomere shortening inatherosclerosis.Lancet，2001，358：472－473.

7 劉龍梅，何雨峰，趙克斌.冠心病患者外周血白細胞端粒長度研究.中國醫(yī)療前沿，2011，6：71－72.

8 Marthews C，Gorenfle I，Scott S，etal.Vaseular smooth muscle cells undergo telomere－based senescence in human atherosclerosis：effects of telomerase and oxidative strass.Grculation Research.2006，99：156－164.

9 Willeit P，Willeit J，Brandstattur A，etal.Cellular agingreflected by leukocyte telomere leogth predicts advanced atherosclerosis and cardiovascular disense1 risk Arteriosclerosis 771 rombosis and Vascular Biology 2010，30：1649－1656.