周勇軍 李龍平 王新華 侯敢 黃迪南

524000 湛江市，廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室（侯敢 黃迪南）

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤，病死率極高。目前，肝癌治療仍以手術(shù)為首選，但手術(shù)切除的突出問題是切除率低，就診患者中適合手術(shù)切除者不足25%，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，根治性切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率達 61.5%［1，2］。腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factorα，TNF－α）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強的細胞因子，但TNF－α不能持續(xù)、長期、大劑量使用，大大限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，降低TNF－α的毒副作用、增強靶向性和延長其生物半衰期是解決這一難題的三個關(guān)鍵。本課題組制備新型的重組人腫瘤壞死因子α（recombinant human tumor necrosis factor－α，rhTNF－α），體外抗腫瘤活性高，局部用藥或聯(lián)合用藥更顯示出療效好、毒副作用少等優(yōu)勢［3］。5－氟尿嘧啶（5－FU）雖已用于治療多種腫瘤，但有諸多副作用，5＇－脫氧氟尿苷（5＇－dFUrd）是一新型的氟尿嘧啶前體藥，具有更強的腫瘤選擇性和更小的副作用，本身無細胞毒作用，需在體內(nèi)經(jīng)過多步酶解反應(yīng)才能生成有化療作用的 5－FU。胸苷磷酸化酶（thymidine phsphorylase，TP）在腫瘤組織內(nèi)催化 5＇－dFUrd、卡培他濱等5－FU的前體藥轉(zhuǎn)化為有細胞毒作用的5－FU，是發(fā)揮關(guān)鍵作用的限速酶，腫瘤組織中TP的表達水平能夠預(yù)測腫瘤對5－FU化療藥物的敏感性［4］。本文以人肝癌細胞HepG－2為研究對象，探討rhTNF－α在體外對肝癌細胞生長抑制、侵襲能力及化療藥物敏感性的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人肝癌細胞HepG－2由廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室細胞庫提供。

1.2 主要試劑 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購于美國Sigma公司；人rhTNF－α細胞因子由廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室贈送，以每管100μl分裝 eppendorf管，濃度為 5×103ng／mL，－20 °C 低溫保存?zhèn)溆?；RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于杭州吉諾公司；去生長因子Matrigel、TP檢測試劑盒購于美國B＆D公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將HepG－2細胞接種于含10%滅活胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，2－3 d傳代 1次。

1.3.2 MTT 比色法檢測 rhTNF－α 對 HepG－2 細胞的生長抑制作用 將處于對數(shù)生長期的HepG－2細胞用0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)液調(diào)成濃度為 5.8×104／mL 的細胞懸液，以每孔100μl體積接種于三塊96孔板中，置37℃，50 ml／LCO2孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，加入含有rhTNF－α的新鮮培養(yǎng)液200 μl，使終濃度分別為 10 ng／mL（試驗組 A）、50 ng／mL（試驗組 B）、100 ng／mL（試驗組 C）、200ng／mL（試驗組D），每種濃度組以及陰性對照組均設(shè)3個復(fù)孔，分別在加藥后24 h、48 h、72 h后加入MTT（10 mg／mL）20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，吸出孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩 10 min，以 530 nm為測定波長，630 nm為參考波長，觀察細胞形態(tài)并用450型自動酶標儀檢測各孔A值，計算抑制率。細胞抑制率＝（對照組A值－藥物處理組A值）／對照組A值×100%。

1.3.3 體外侵襲實驗 先用不同濃度 rhTNF－α作用 HepG－2 細胞 24 h，用無血清 RPMI－1640 按 1∶10稀釋Matrigel膠，每個Transwell小室鋪入20μl稀釋過的Martigel膠，置37℃孵育0.5 h。胰酶消化細胞，用含5%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為3×104／mL。在每個Transwell下室中加入600μl含20%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，上室中加入200μl細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，去除外室內(nèi)培養(yǎng)基，用甲醇固定5 min，然后用1%結(jié)晶紫染色20 min。自來水沖洗后用棉簽擦去Matrigel膠和上室內(nèi)的細胞，快速風(fēng)干，切下小室的聚碳酸酯膜后貼在載玻片上，用中性樹脂封片。在400倍顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)，取平均數(shù)。

1.3.4 ELISA法檢測腫瘤細胞中TP水平 將處于對數(shù)生長期的HepG－2細胞用0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液調(diào)成濃度為 5.8×104／mL 的細胞懸液，以每孔 100 μl體積接種于三塊96孔板中，置37℃，50 ml／L CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，加入含有rhTNF－α的新鮮培養(yǎng)液200μl，使終濃度分別為10 ng／mL（試驗組 A）、50 ng／mL（試驗組 B）、100 ng／mL（試驗組 C）、200 ng／mL（試驗組 D），每個濃度組以及陰性對照組均設(shè)3個復(fù)孔，置37℃，50 ml／L CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出孔內(nèi)上清液并檢測TP水平。

1.3.5 MTT比色法檢測5＇－dFUrd和5－FU 對HepG－2細胞抑制實驗 將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)液調(diào)成濃度為 5.8×104／mL 的細胞懸液，以每孔100μl體積接種于三塊96孔板中，置37℃，50 ml／L CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)液，分別加入含有 5－FU（1 mg／L）、5＇－dFUrd（1 mg／L）的新鮮培養(yǎng)液 200 μl（每孔設(shè) 3 個復(fù)孔），置37℃，50 ml／LCO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入含有 rhTNF－α的新鮮培養(yǎng)液 200μl，使終濃度分別為 10 ng／mL（試驗組 A）、50 ng／mL（試驗組 B）、100 ng／mL（試驗組 C）、200 ng／mL（試驗組D），每種濃度組以及陰性對照組均設(shè)3個復(fù)孔。在加藥 72 h 后加入 MTT（10 mg／mL）20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，吸出孔內(nèi)上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min，以530 nm為測定波長，630 nm為參考波長，觀察細胞形態(tài)并用450型自動酶標儀檢測各孔A值。按如下公式計算增殖抑制率。細胞增殖抑制率＝（對照組A值－藥物處理組A值）／對照組A值×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用±s表示，多組間計量資料的比較采用方差分析，HepG－2肝癌細胞對5＇－dFUrd的敏感性與細胞中TP水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhTNF－α對HepG－2 肝癌細胞的生長抑制作用結(jié)果 不同濃度的rhTNF－α作用HepG－2細胞后，各藥物處理組抑制率均增高，10～200 ng／mL的rhTNF－α均呈現(xiàn)量－效與時－效關(guān)系，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞生長抑制率逐漸升高，200 ng／mL的rhTNF－α作用72 h引起的生長抑制率最高，見圖1。

圖1 不同濃度rhTNF－α對HepG－2肝癌細胞的抑制作用

2.2 rhTNF－α 對 HepG－2 細胞體外侵襲性影響本實驗采用了Matrigel膠模擬基質(zhì)的方法檢測細胞的侵襲能力。經(jīng)rhTNF－α作用的HepG－2細胞（實驗組）的侵襲能力明顯高于未作用細胞（對照組），且rhTNF－α濃度越高，HepG－2細胞侵襲能力越強，見圖2～5。

圖2 不同濃度rhTNF－α對HepG－2肝癌細胞侵襲能力的影響

圖3 未經(jīng)rhTNF－α處理的細胞侵襲能力（×400）

圖4 經(jīng)50 ng／mL rhTNF－α處理的細胞侵襲能力（×400）

圖5 經(jīng)200 ng／mLrhTNF－α處理的細胞侵襲能力（×400）

2.3 不同劑量rhTNF－α對HepG－2肝癌細胞中TP水平的影響 rhTNF－α能明顯提高HepG－2肝癌細胞中TP水平的表達。TP水平隨著rhTNF－α濃度的增加而增加，對照組及各試驗組間TP的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝12.062，P＝0.014）。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見表1。

表1 不同劑量rhTNF－α對HepG－2肝癌細胞中TP 水平的影響（±s）

表1 不同劑量rhTNF－α對HepG－2肝癌細胞中TP 水平的影響（±s）

注：＊與對照組比較，P＝0.011，P＝0.001，P＝0.001，P＝0.001；★與試驗組 A 比較，P＝0.020，P＝0.002，P＝0.001；＃與試驗組 B 比較，P＝0.040，P＝0.009；○與試驗組 C 比較，P＝0.036

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2.4 rhTNF－α與5－FU 及 5′－dFUrd 聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細胞化療敏感性的影響 rhTNF－α與5－FU聯(lián)合應(yīng)用對提高HepG－2肝癌細胞對化療藥物的敏感性無明顯影響，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.485，P＝0.692）。rhTNF－α與5′－dFUrd 聯(lián)合應(yīng)用可提高HepG－2肝癌細胞對化療藥物的敏感性，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝26.630，P＝0.006），且隨著 rhTNF－α濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。細胞對5′－dFUrd敏感性的增加與rhTNF－α上調(diào)TP呈正相關(guān)性（r＝0.679，P＝0.001），見表2。

3 討論

表2 rhTNF－α與5－FU 及 5′－dFUrd 聯(lián)合應(yīng)用對 HepG－2肝癌細胞化療敏感性的影響（±s，%）

表2 rhTNF－α與5－FU 及 5′－dFUrd 聯(lián)合應(yīng)用對 HepG－2肝癌細胞化療敏感性的影響（±s，%）

注：＊與對照組比較，P＝0.004，P＝0.002，P＝0.001，P＝0.001；★與試驗組 A 比較，P＝0.003，P＝0.001，P＝0.001；＃與試驗組 B 比較，P＝0.003，P＝0.002；○與試驗組 C 比較，P＝0.008

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惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的頭號殺手，手術(shù)、放療和化療是治療腫瘤的常用方法。肝細胞癌屬于最難治療的惡性腫瘤之一，手術(shù)治療是首選，但切除率低、復(fù)發(fā)率高，早期治療、綜合治療及優(yōu)化個體治療方案是新的治療肝癌的方向。其中篩選安全有效、副作用小的抗腫瘤藥物一直是研究重點。腫瘤靶向治療是利用特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性物質(zhì)選擇性地運送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應(yīng)盡量限定在特定的靶細胞、組織或器官內(nèi)，而不影響正常細胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法。利用生物工程技術(shù)在分子水平改建細胞因子結(jié)構(gòu)以增強其抗瘤活性和降低毒性的有效探索，有望為細胞因子治療腫瘤開辟一條新的途徑。TNF－α是一類由單核－巨噬細胞及其他多類細胞合成、釋放，引起全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的多效炎癥性細胞因子?？苫罨奘杉毎罨木奘杉毎哂袕娏业臍⒘鲂?yīng)，同時能增強IL－2誘生的淋巴因子激活殺傷細胞（lymphokine activated killer cells，LAK），使 LAK 細胞增多從而增強抗腫瘤作用，并且能誘導(dǎo)干擾素及IL－1 產(chǎn)生，兩者進而發(fā)揮抗腫瘤活性［5］。TNF－α 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強的細胞因子，其顯著特征是，在體內(nèi)外均能特異性地直接殺傷腫瘤細胞。TNF－α的抗腫瘤作用，引起了人們的極大關(guān)注，成為細胞因子研究的新熱點。TNF－α抗腫瘤的分子機理非常復(fù)雜，就現(xiàn)階段而言主要是受體引發(fā)的信號傳導(dǎo)機制：TNF－α抗腫瘤的機理主要是通過與兩個受體結(jié)合而發(fā)揮細胞毒反應(yīng)，TNF－α的活性三聚體趨化細胞表面的3個受體共同參加反應(yīng)，然后通過細胞內(nèi)一系列的接頭蛋白參與反應(yīng)［6］。細胞中的TRADD接頭蛋白，首先被活化聚集在TNF－α受體的胞內(nèi)部分，然后再活化另外3個接頭蛋白FADD、RIP 以及 TRAF2［7］。其中 FADD 通過活化 caspase－8引發(fā)細胞凋亡。而TRAF2的作用是雙重的，既可以激活cIAP引發(fā)細胞抗凋亡的反應(yīng)，又可以激活細胞的JNK途徑，通過c－JUN調(diào)節(jié)核內(nèi)與細胞凋亡相關(guān)基因的表達，引發(fā)細胞凋亡產(chǎn)生細胞毒反應(yīng)。RIP則活化一種蛋白激酶－IKK復(fù)合物，作用于NF－κβ，使其Iκβ基團游離，NF－κβ分子量因此變小進而能穿過核膜進入核內(nèi)調(diào)控各種基因。其結(jié)果是抑制細胞凋亡和促進炎癥反應(yīng)。TNF－α是一種具有較強免疫活性的細胞因子，通過對腫瘤細胞的細胞毒作用以及免疫調(diào)節(jié)作用而抑制腫瘤細胞的增殖，此作用主要是TNF－α通過與腫瘤細胞膜上的特異受體的結(jié)合，利用細胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細胞進入編程性死亡通路，引起細胞凋亡。牛朝詩等［8］探討TNF－α對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)活性的影響，應(yīng)用MTT法研究經(jīng)TNF－α處理的大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞的生長和增殖活性，結(jié)果表明TNF－α對體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細胞的生長和增殖具有抑制作用，并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)rhTNF－α能抑制肝癌細胞 HepG－2 的增殖，50 mg／mL rhTNF－α處理48 h可見細胞的增殖發(fā)生明顯的抑制，抑制效果隨濃度增加而增加，并且隨作用時間的延長而增加，具有劑量和時間雙依賴性。

腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)的侵襲破壞是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，其中腫瘤細胞穿過基膜的移動參與了腫瘤侵襲的全過程。目前體外研究腫瘤細胞侵襲行為的簡便和快速有效的方法是Matrigel膠模擬基質(zhì)檢測細胞侵襲能力實驗，其基本原理是在體外應(yīng)用Matrigel膠模擬胞外基質(zhì)，有侵襲力的腫瘤細胞能在一定時間內(nèi)穿過Matrigel膠，腫瘤細胞的侵襲力越強，消化穿透Matrigel膠的腫瘤細胞就越多。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhTNF－α能夠增強HepG－2細胞的體外侵襲能力，且隨rhTNF－α濃度增加，HepG－2細胞侵襲能力增加，具有劑量依賴性，說明rhTNF－α能促進肝癌細胞的侵襲性，其可能的機制是通過調(diào)控HepG－2中細胞表面黏附因子CD15和CD15s的含量，使CD15s上調(diào)，CD15下調(diào)，從而增強HepG－2細胞的侵襲能力，提高其轉(zhuǎn)移潛力［9］。

TNF－α與多種化療藥物具有協(xié)同作用，有學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)將TNF－α與放化療聯(lián)合應(yīng)用于中晚期腫瘤治療，可大大提升放、化療的敏感性。de Lima等［10］將TNF－α與化療藥物美法侖（melphalan）聯(lián)合使用，在晚期黑色素瘤和軟組織肉瘤的臨床試驗治療中發(fā)現(xiàn)二者同時使用可以大大地提高治療效果，認為TNF－α可選擇性地使腫瘤內(nèi)皮細胞破壞、溶解，使美法侖在腫瘤部位的藥物濃度增加，增強了美法侖對腫瘤細胞的毒性，從而產(chǎn)生了強大的抗腫瘤效果，并且顯著減緩了人胰腺癌腫瘤的增殖和生長，且無明顯的系統(tǒng)毒性等副作用，可以有效的治療晚期黑色素瘤和軟組織瘤。但目前尚未有相關(guān)的研究在肝腫瘤中開展，并且TNF－α與化療藥物協(xié)同作用的機理及調(diào)控機制未完全清楚。本文研究結(jié)果顯示：rhTNF－α能明顯提高HepG－2肝癌細胞TP水平的表達，且表現(xiàn)出劑量依賴性，隨著rhTNF－α濃度增加TP蛋白表達增加，還能明顯提高HepG－2肝癌細胞對 5－FU 前體藥物的敏感性（P＜0.05），5－FU 前體藥物敏感性的增加與rhTNF－α上調(diào)TP水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r為 0.679（P＝0.001）。提示 rhTNF－α主要通過上調(diào)HepG－2肝癌細胞TP表達水平來增加其對5－FU前體藥物的敏感性。但rhTNF－α上調(diào)TP酶蛋白的具體機制目前尚不十分清楚。有研究［11］發(fā)現(xiàn)TNF－α可以提高結(jié)腸癌細胞的TP表達，這一作用主要通過II型受體（TNF－αR2）而不是 I型受體來實現(xiàn)，TP活性的提高與TPmRNA的表達水平有關(guān)，R2受體在上調(diào)TP酶蛋白的表達中起了重要作用。

總之，適當(dāng)劑量rhTNF－α能明顯抑制HepG－2細胞生長，上調(diào)腫瘤細胞中TP的表達，增強腫瘤細胞5－FU前體藥物的敏感性，但在體外也能增強腫瘤細胞的侵襲能力，其在體內(nèi)是否能夠增強腫瘤細胞的侵襲能力，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移尚需進一步研究。本文研究為rhTNF－α與5－FU前體藥聯(lián)合應(yīng)用于治療肝細胞癌提供了實驗室依據(jù)，相信rhTNF－α在抗腫瘤的應(yīng)用中有更廣闊的前景。

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