林瀛 陳小巖 俞訓(xùn)彬

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobaeteriumtuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，為世界三大傳染病之一。近年來，我國的TB發(fā)病率持續(xù)上升，其中肺結(jié)核患病人數(shù)居全球第二位，TB的發(fā)病率和病死率在我國27種法定傳染病中均居首位［1］。傳統(tǒng)的活體組織MTB檢測方法如細(xì)菌培養(yǎng)法、抗酸染色法等檢測周期較長，且陽性率低，漏檢率較高。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟發(fā)展，實時熒光定量PCR（real－timefluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q－PCR）技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測。本文采用FQ－PCR法對TB患者石蠟包埋病理組織中的MTB－DNA進(jìn)行檢測，同時與抗酸染色和組織病理形態(tài)學(xué)檢查進(jìn)行比較，評價其在臨床活體組織病理診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2013年5月至2015年2月間臨床確診的TB患者144例，其中男性75例，女性 69例，平均年齡（45.0±18.4）歲。取上述患者的病理組織石蠟包埋組織標(biāo)本，其中肺活檢組織標(biāo)本29份，肺葉切除組織標(biāo)本19份，胸膜活檢組織標(biāo)本16份，淋巴結(jié)活檢組織標(biāo)本37份，其他活檢組織包括腸、聲帶、腎、舌、網(wǎng)膜、宮腔、腦、腮腺、附睪、乳腺和皮膚等標(biāo)本43份。

1.2 儀器與試劑 石蠟包埋組織提取基因組DNA試劑盒及MTB核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，組織切片抗酸菌染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Rotor gene－QFQ－PCR分析儀購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，TZL－32干式恒溫器購自蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司，5424R小型臺式高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf（中國）有限公司。

1.3 石蠟包埋組織提取基因組DNA 將蠟塊樣本與檢測單核對患者病例號、姓名、住院號、檢查項目，保證樣本正確無誤。所有試劑放在室溫平衡，調(diào)節(jié)金屬浴至56℃。確保石蠟包埋組織中含有病變細(xì)胞，所取部分盡量在蠟塊中部，大活檢組織標(biāo)本連續(xù)切5張厚度5μm組織片，小活檢組織標(biāo)本連續(xù)切10張厚度5μm組織片。每次更換蠟塊同時更換切片機(jī)刀片，防止污染。轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本至PCR實驗室II區(qū)開始DNA提取。每個樣本EP管加入1 ml二甲苯，置漩渦振蕩器劇烈漩渦震蕩10 s，高速離心機(jī)在室溫下以離心半徑 8.4 cm，14 000 r／min 離心 2 min，棄去上清。必要時可重復(fù)一次脫蠟。每個樣本EP管加入1 ml無水乙醇，置漩渦振蕩器劇烈漩渦震蕩10 s，高速離心機(jī)在室溫下以離心半徑8.4 cm，14 000 r／min離心2 min，棄去上清。開蓋，置于56℃的金屬浴中蒸干5 min，直至所有殘留酒精揮發(fā)，期間觀察底部沉淀是否發(fā)白，有干裂的跡象。向沉淀加入180μl Buffer ATL和20μl蛋白酶K，用槍頭攪拌，使沉淀盡量散開，轉(zhuǎn)移至已預(yù)先設(shè)好56℃的金屬浴。56℃孵育1 h或者過夜孵育。置瞬時離心機(jī)以離心半徑4.0 cm，7200 r／min 離心 10 s，90 ℃金屬浴孵育 1 h。置瞬時離心機(jī)以離心半徑 4.0 cm，7200 r／min 離心10 s，上機(jī)自動提取核酸。采用微量紫外分光光度計測定提取的DNA質(zhì)量和濃度，所提樣本DNA的OD260／280一般應(yīng)在 1.8～2.0 之間，OD260／230一般應(yīng)大于2.0。提取出的DNA立即進(jìn)行檢測。

1.4 FQ－PCR 檢測方法

1.4.1 試劑配制 取出 TB的 PCR反應(yīng)液、Taq酶和UNG酶，室溫融化后，置瞬時離心機(jī)以離心半徑4.0 cm，7200 r／min 離心 10 s，設(shè)所需要的管數(shù)為 N｛N＝標(biāo)本數(shù)＋1（強(qiáng)陽性對照）＋1（臨界陽性對照）＋1（陰性對照）｝，按每管 PCR 反應(yīng)液 37.8 μl，Taq 酶0.2 μl，UNG 0.06 μl，計算好各試劑的使用管，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合混勻。向設(shè)定的PCR反應(yīng)管中加入38μl反應(yīng)混合液，蓋上蓋子。

1.4.2 加樣 在設(shè)定的反應(yīng)管中分別加入樣本DNA 2 μl，陰性對照 2 μl（ATE 緩沖液），強(qiáng)陽性對照2 μl，臨界陽性對照 2 μl，蓋緊蓋子。

1.4.3 PCR擴(kuò)增 將PCR反應(yīng)管置于瞬時離心機(jī)，以離心半徑 4.0 cm，7200 r／min 離心 10 s，使加入反應(yīng)管中的液體溶于管底，將PCR反應(yīng)管放入FQPCR儀器。打開儀器窗口，直接從模板中調(diào)取已經(jīng)預(yù)先設(shè)置好反應(yīng)條件的模板文件（TB反應(yīng)條件），反應(yīng)體系為 40 μl：PCR 反應(yīng)液 37.8 μl，Taq 酶 0.2 μl，UNG 0.06 μl，混勻后取 38 μl反應(yīng)混合液，再加入樣本 2.0μl。反應(yīng)條件：第一階段 37℃，5 min；94℃，1 min；第二階段 95℃，5 s；60℃，30 s，40個循環(huán)。

1.4.4 結(jié)果判斷

1.4.4.1 基線的確定 取 6～10 或 6～15 個循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值＝40.0 為準(zhǔn)。

1.4.4.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 陰性對照的 Ct值均應(yīng)等于40.0 或無數(shù)值，強(qiáng)陽性對照的 Ct值應(yīng)＜25.0，臨界陽性對照的Ct值應(yīng)＜35.0，且臨界陽性對照的Ct值應(yīng)大于強(qiáng)陽性對照的Ct值。否則，此次實驗視為無效。

1.4.4.3 檢驗結(jié)果的解釋 檢測樣本 Ct值為 40.0或者無數(shù)值，報告為陰性；檢測樣本Ct值≤37.0為陽性；檢測樣本Ct值＞37.0重新檢測，若樣本Ct值＜40則為陽性，否則報告為陰性。

1.5 抗酸染色檢測方法 按抗酸菌染色試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察到紅色桿菌為陽性結(jié)果，否則報告為陰性。

1.6 組織病理學(xué)檢測方法 通過觀察組織石蠟切片，結(jié)核結(jié)節(jié)常表現(xiàn)為由上皮樣細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及外周局部集聚的淋巴細(xì)胞和少量反應(yīng)性增生的成纖維細(xì)胞構(gòu)成，結(jié)節(jié)中央常有干酪樣壞死。以病理最終診斷報告中出現(xiàn)“符合結(jié)核病變”作為陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，否則判定為陰性結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用雙向無序RC表卡方檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測方法診斷MTB的陽性率比較 在144份臨床診斷TB的病理組織標(biāo)本中，應(yīng)用FQPCR法、抗酸染色法和組織病理學(xué)法檢測MTB的陽性率分別為 47.22%、15.28%和51.39%，三者陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中 FQ－PCR 法和組織病理學(xué)法的陽性率均顯著高于抗酸染色法，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），而 FQ－PCR 法與組織病理學(xué)法的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三種方法對144份臨床活檢組織標(biāo)本的檢測情況

2.2 三種方法對不同組織類型的結(jié)核病理組織標(biāo)本診斷陽性率的比較 除肺葉切除標(biāo)本外，三種方法檢測其他組織類型標(biāo)本的MTB陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。除肺葉切除標(biāo)本外，F(xiàn)Q－PCR法及組織病理學(xué)法對其他組織類型標(biāo)本的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜0.05）；FQ－PCR 法與組織病理學(xué)法的MTB陽性檢出率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。

3 討論

表2 不同部位組織三種方法的MTB陽性檢出率比較［n（%）］

TB是由MTB引起的呼吸道傳染性疾病，可經(jīng)淋巴管、血液及消化道等途徑傳播至肺外臟器而致病。TB病原學(xué)檢測是發(fā)現(xiàn)MTB的主要途徑和手段。抗酸染色涂片檢查MTB的優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速、廉價和定位準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是特異性差、敏感性低，通常標(biāo)本的細(xì)菌濃度需達(dá)10 000個／mL以上才能得到陽性結(jié)果，而且不能區(qū)分MTB和非MTB，并受觀察者主觀因素影響，容易造成漏診和誤診。分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法是目前TB確診最可靠的方法，被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”［2］，其靈敏度高，理論上來說細(xì)菌濃度低至數(shù)個／mL都可培養(yǎng)出來，并可鑒定死菌與活菌，缺點(diǎn)是檢測周期長，通常需4－8 w才能獲得結(jié)果，而且MTB與非MTB的鑒別需進(jìn)一步行菌種鑒定，已無法滿足臨床診治需求。血清學(xué)方法檢測存在抗原交叉反應(yīng)以及體液免疫與TB相關(guān)性不明確的缺陷。對于肺外結(jié)核病變，臨床工作中通常需要活體組織病理診斷來確定病變是否為MTB感染，從而確定治療方案。組織病理學(xué)檢查是診斷TB非常重要的手段，通過觀察組織石蠟切片典型的病理學(xué)鏡下特征來確診。典型的結(jié)核結(jié)節(jié)常表現(xiàn)為由上皮樣細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及外周局部聚集的淋巴細(xì)胞和少量反應(yīng)性增生的成纖維細(xì)胞構(gòu)成，結(jié)節(jié)中央常有干酪樣壞死［3］。以增殖為主的病變中，結(jié)核結(jié)節(jié)較多，易于觀察，但是對于以滲出為主的病變或缺乏典型的組織形態(tài)特點(diǎn)時，典型的結(jié)核結(jié)節(jié)少見，難以確診，只能做出可能性病理診斷，不能及時有效地為臨床治療提供有利的診斷依據(jù)。近年來文獻(xiàn)［4］報道表明，F(xiàn)QPCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)、病原體檢測等諸多研究領(lǐng)域，并被成功用于微生物快速定量檢測。

本文研究采用的試劑盒用一對MTB特異性引物和一條MTB特異性熒光探針，利用PCR體外擴(kuò)增法檢測MTB－DNA。當(dāng)反應(yīng)體系中有目的基因片段存在時，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，釋放出熒光，通過實時監(jiān)測不同通道的熒光信號，可以進(jìn)行MTB定量分析，檢測靈敏度為10個TB菌／mL。PCR是非常敏感的技術(shù)，只要在切完一個蠟塊標(biāo)本后未完全清潔刀片，或者DNA抽提過程中，由于氣溶膠、加樣槍、手套等污染，均可導(dǎo)致假陽性的結(jié)果，這些結(jié)果常表現(xiàn)為較低的定量值。而FQ－PCR實現(xiàn)了閉管檢測，已消除了產(chǎn)物污染的可能性，但標(biāo)本間的污染也可能產(chǎn)生假陽性，因此必須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，防止污染的產(chǎn)生。在144份臨床診斷TB患者的組織樣本中，F(xiàn)Q－PCR法的陽性率為47.22%，略低于組織病理學(xué)檢測，但顯著高于抗酸染色法，三者陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。李秀斌等［5］的研究顯示，病理診斷為TB患者的石蠟包埋組織 MTB－DNA 陽性率為 93.14%。余琦等［6］在 196 份臨床診斷TB的石蠟包埋組織中，利用FQ－PCR法檢測到陽性136份，陽性率為69.39%。王旭洲等［7］采用FQ－PCR技術(shù)對200例（HE染色病理診斷）符合或疑為TB的石蠟包埋組織進(jìn)行MTB／非MTB檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)Q－PCR 檢測陽性率為 51.50%，高于抗酸染色和金胺O染色，證明該技術(shù)具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，可以用于TB和非TB的肉芽腫病理診斷。Seo等［8］比較了巢式PCR及FQ－PCR方法在福爾馬林固定、石蠟包埋的各種組織標(biāo)本的MTB陽性檢出率，四種不同商業(yè)用試劑盒FQ－PCR陽性檢出率為31.3%～80.0%不等。本文研究中FQ－PCR 法檢測MTB的陽性率在Seo等［8］研究結(jié)果的陽性率范圍內(nèi)，而低于李秀斌、余琦、王旭洲等［5－7］的研究結(jié)果，原因可能是由于商業(yè)用試劑盒引物設(shè)計不同導(dǎo)致。PCR法具有檢測速度快，靈敏度高，準(zhǔn)確度高的特性，而與組織病理學(xué)檢測相比，F(xiàn)Q－PCR法可能受到組織標(biāo)本類型、標(biāo)本保存時間、DNA抽提過程、引物濃度、探針序列等因素的影響，因此本文研究中，F(xiàn)Q－PCR陽性率低于組織病理學(xué)檢查陽性率的可能原因是組織經(jīng)石蠟包埋處理過程中，福爾馬林固定液引起蛋白交聯(lián)導(dǎo)致 DNA 損傷。國外研究［9，10］提示，新鮮組織標(biāo)本的FQ－PCR結(jié)果具有更高的敏感性和特異性，而本文為回顧性研究，因此組織標(biāo)本的存儲時間對檢測結(jié)果可能也有影響。

本文研究還對不同部位組織標(biāo)本采用不同方法檢測的陽性檢出率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，在各類組織標(biāo)本中FQ－PCR檢測法的陽性檢出率均較高，相較于痰、體液等標(biāo)本，石蠟包埋組織直接取材于結(jié)核的病灶部位，檢測的陽性率相對更高，特異性強(qiáng)。FQPCR法在肺活檢組織、肺葉切除標(biāo)本及胸膜活檢標(biāo)本中的陽性檢出率均高于其他檢測方法，而淋巴結(jié)及其他組織活檢標(biāo)本診斷結(jié)核陽性率低于組織病理學(xué)檢查，可能與不同組織處理過程中MTB－DNA丟失程度不同，或者病變組織切片小所含的TB菌量少，低于檢測下限而被判為陰性有關(guān)。此外，試劑和實驗操作的差異也可影響低濃度標(biāo)本的檢出。

綜上所述，F(xiàn)Q－PCR檢測石蠟切片組織標(biāo)本的MTB－DNA，具有簡便、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，對于組織病理學(xué)改變不典型的病例，且無法進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的組織，結(jié)合組織標(biāo)本的MTB－DNA檢測結(jié)果，可進(jìn)一步提高活體組織中MTB感染診斷的準(zhǔn)確度和特異性，在TB的早期診斷上具有良好的臨床實用價值。

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