劉文秀 崔紅霞 韓爽 劉大鵬 徐菲 張宏宇 房丹丹 王雪婷

161000 齊齊哈爾市，齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系（崔紅霞）

鮑曼不動(dòng)桿菌是氧化酶陰性、不發(fā)酵糖類的革蘭氏陰性桿菌。銅綠假單胞菌是假單胞菌屬的代表菌，屬非發(fā)酵條件下致病菌。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用或某些介入性檢查／治療的采用，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要致病菌，甚至成為重癥監(jiān)護(hù)病房、急診科及外科病房的定植菌。細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象不僅表現(xiàn)在耐抗生素上，而且已經(jīng)擴(kuò)展到耐消毒劑。此類耐消毒劑菌株的出現(xiàn)可能會(huì)導(dǎo)致醫(yī)院消毒的失敗，甚至導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)。有報(bào)道［1］顯示，qac基因的外排泵可將季銨鹽類化合物排出菌體，其中由整合子介導(dǎo)的qacEΔ1基因可被革蘭氏陰性菌獲取，從而產(chǎn)生對(duì)消毒劑的抗性。本文研究以我院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌為目標(biāo)菌，了解其攜帶qacEΔ1耐消毒劑基因情況，并探討該基因?qū)︶t(yī)院常用消毒劑碘伏、含氯制劑和快速手消毒劑的消毒效果的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集我院2012年1月至2014年12月臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌各30株，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株，所有菌株均經(jīng)過法國(guó)梅里埃ATB1525型細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 耐消毒劑基因qacEΔ1的檢測(cè)

1.2.1 DNA模板的制備 用 5 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）將菌齡18－24 h的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌培養(yǎng)物洗下，取1 ml菌懸液置于1.5 ml Eppendorf管中，11 000×g離心 2 min，棄上清。加入 200μl無菌純水重懸，在沸水中煮10 min后，立即在冷水中冷卻，11 000×g 離心 2 min，取上清液 2.5 μl作為DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.2 PCR引物 按美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（ncbi）已登錄的 qacEΔ1 基因序列（登錄號(hào) u12338）自行設(shè)計(jì)引物。由上海生工生物工程有限公司合成，引 物 序 列 為 ：qacEΔ1－F TAGCGAGGGCTTTACTAAGC，qacEΔ1－R ATTCAGAATGCCGAACACCG，目標(biāo)產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp。

1.2.3 PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液2.5 μl，dNTP（2.5 mmol／L）2 μl，ExTaqDNA 聚合酶（5 U／μl）0.3 μl，qacEΔ1－F（10 μmol／L）1.0 μl，qacEΔ1－R（10 μmol／L）1.0 μl，DNA 模板 2.5 μl，無菌純水補(bǔ)足至 25.0 μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 5 min→94℃30 s→55℃30 s→72℃60 s，共循環(huán)30周期，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè) 取 PCR 產(chǎn)物 5μl，在1%瓊脂糖凝膠上以120 V電壓電泳20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3 消毒劑抗力試驗(yàn)

1.3.1 菌懸液制備 取各實(shí)驗(yàn)菌培養(yǎng)18－24 h的新鮮斜面培養(yǎng)物，用含1000 mg／L胰蛋白胨的生理鹽水稀釋液（TPS）洗下菌苔，經(jīng)充分震蕩混勻，稀釋配置成菌含量為 1×107～1×108CFU／mL 的菌懸液。

1.3.2 試驗(yàn)消毒劑 含碘消毒劑：碘伏，含有效碘5000 mg／L，用硬水稀釋成 75 mg／L、150 mg／L 及300 mg／L備用；含氯消毒劑：氯片，含有效氯500 mg／L； 分別用硬水稀釋成 125 mg／L、250 mg／L 及500 mg／L備用。醇類消毒劑：百能免洗手消毒液，原倍使用。

1.3.3 中和劑 經(jīng)中和劑鑒定試驗(yàn)確定，碘伏中和劑為10 g／L硫代硫酸鈉＋3 g／L吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯；含氯制劑的中和劑為5 g／L硫代硫酸鈉＋1 g／L吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯；快速手消毒液的中和劑為2 g／L卵磷脂＋20 g／L吐溫80的營(yíng)養(yǎng)肉湯。

1.3.4 懸液定量殺菌試驗(yàn) 在無菌試管中加入1.0 ml試驗(yàn)用菌懸液和4.0 ml試驗(yàn)濃度消毒劑（陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液），混合均勻，分別作用1 min、5 min和7 min。取 0.5 ml混合液加入到含 4.5 ml相應(yīng)中和劑的試管中混合均勻，然后取1.0 ml混合液傾注法接種培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均滅菌率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。平均滅菌率采用±s表示，qacEΔ1基因陽性菌株和陰性菌株間平均滅菌率比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌攜帶qacEΔ1基因情況 在30株鮑曼不動(dòng)桿菌中，有22株攜帶qacEΔ1 基因，陽性率為 73.3%（22／30）。在 30 株銅綠假單胞菌中，有18株攜帶qacEΔ1基因，陽性率為 60.0%（18／30）。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌 ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853的qacEΔ1基因檢測(cè)均為陰性，圖1為耐消毒劑qacEΔ1基因PCR產(chǎn)物電泳圖。

圖1 耐消毒劑qacEΔ1基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)碘伏的抗力試驗(yàn)結(jié)果 有效碘對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌及質(zhì)控菌株的滅菌率均隨時(shí)間和劑量的提高而提高，呈現(xiàn)明顯的量－效關(guān)系和時(shí)－效關(guān)系。在滅菌1 min時(shí)，除300 mg／L有效碘對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌qacEΔ1基因陽性菌株滅菌率均低于基因陰性菌株，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）外，其他濃度下有效碘對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株滅菌率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。其他作用時(shí)間下不同濃度有效碘對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌qacEΔ1基因陽性菌株的滅菌率均低于qacEΔ1基因陰性菌株，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），詳見表1。

2.3 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)有效氯的抗力試驗(yàn)結(jié)果 有效氯對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌及質(zhì)控菌株的滅菌率均隨時(shí)間和劑量的提高而提高，呈現(xiàn)明顯的量－效關(guān)系和時(shí)－效關(guān)系。不同濃度的有效氯在作用5 min、7 min時(shí)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌qacEΔ1基因陽性菌株滅菌率均低于基因陰性菌株，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；在作用 1 min 時(shí)，500 mg／L 有效氯對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌qacEΔ1基因陽性菌株滅菌率低于陰性菌株，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但對(duì)銅綠假單胞菌qacEΔ1基因陽性與陰性菌株滅菌率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

2.4 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)快速手消毒劑的抗力試驗(yàn)結(jié)果 快速手消毒劑對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌及質(zhì)控菌株的滅菌率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，呈現(xiàn)明顯的時(shí)－效關(guān)系?？焖偈窒緞┰谧饔? min、5 min和7 min時(shí)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌qacEΔ1基因陽性菌株滅菌率均低于基因陰性菌株，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），詳見表3。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌是臨床各科室尤其是重癥監(jiān)護(hù)室和急診室的常見條件致病菌。隨著消毒劑的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象不僅局限在耐抗生素方面，某些細(xì)菌在亞致死量消毒劑或消毒劑使用時(shí)間不當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)期作用下，會(huì)使菌株保存下來，誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)消毒劑產(chǎn)生抗性［2］。與耐抗生素菌株一樣，耐消毒劑菌株的出現(xiàn)同樣會(huì)導(dǎo)致醫(yī)院消毒的失敗及院內(nèi)感染的發(fā)生。

qacE基因家族表達(dá)細(xì)菌多種化合物外排泵（外排消毒劑耐藥）。qacE基因家族已報(bào)道的亞型有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacJ。qacEΔ1是I類整合子的一部分，由整合子介導(dǎo)，可被革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌廣泛獲?。?］。有報(bào)道［1，4］指出，鮑曼不動(dòng)桿菌不僅對(duì)常用抗生素耐藥性較高，而且qacEΔ1基因攜帶率也較高。本文研究結(jié)果顯示，我院攜帶qacEΔ1耐消毒劑基因的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的陽性率分別為73.3%和60.0%，雖低于黃支密等［5］報(bào)道的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌qacEΔ1基因攜帶率為80%，但同樣不容忽視。

本文研究采用定量殺菌試驗(yàn)檢測(cè)攜帶qacEΔ1基因的菌株對(duì)臨床3種常用消毒劑抗力的影響，結(jié)果顯示，攜帶有qacEΔ1基因的鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌對(duì)有效碘、有效氯及快速手消毒劑的抗力均高于qacEΔ1基因陰性菌株，并且3種消毒劑對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌及質(zhì)控菌株的滅菌率均隨時(shí)間和劑量的提高而提高，呈現(xiàn)明顯的量－效關(guān)系和時(shí)－效關(guān)系。由表1可見，當(dāng)有效碘濃度達(dá)到300 mg／L，且滅菌時(shí)間達(dá) 7 min以上時(shí)，其對(duì)qacEΔ1基因陰性的鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌的滅菌率可達(dá)100.0%，但對(duì)qacEΔ1基因陽性的菌株的滅菌率均在90.0%以下，提示對(duì)于qacEΔ1基因陽性菌株，為達(dá)到完全滅菌的效果，應(yīng)繼續(xù)提高有效碘的濃度或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。由表1、表2及表3綜合分析可知，對(duì)于qacEΔ1基因陽性的鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌，本文研究所設(shè)定的3種消毒劑的最高濃度及最長(zhǎng)作用時(shí)間均未達(dá)到100%滅菌，因此為達(dá)到完全滅菌，應(yīng)通過提高消毒劑的有效濃度或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間來實(shí)現(xiàn)，即所采用的3種消毒劑的濃度及作用時(shí)間均應(yīng)高于本文研究所設(shè)定的最高值，但最佳的滅菌濃度及時(shí)間仍應(yīng)通過后續(xù)試驗(yàn)來完善。本文研究的關(guān)鍵之處在于證明兩種目標(biāo)菌的qacEΔ1基因陽性菌株比qacEΔ1基因陰性菌株對(duì)消毒劑的抗性要強(qiáng)，表現(xiàn)在同等條件下消毒劑對(duì)qacEΔ1基因陽性菌株的滅菌率低于陰性菌株。

表1 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)碘伏的抗力試驗(yàn)結(jié)果（±s，%）

表1 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)碘伏的抗力試驗(yàn)結(jié)果（±s，%）

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表2 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)有效氯的抗力試驗(yàn)結(jié)果（±s，%）

表2 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)有效氯的抗力試驗(yàn)結(jié)果（±s，%）

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表3 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)快速手消毒劑的抗力試驗(yàn)結(jié)果（±s，%）

表3 目標(biāo)菌攜帶qacEΔ1基因陽性菌株與陰性菌株對(duì)快速手消毒劑的抗力試驗(yàn)結(jié)果（±s，%）

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綜上所述，耐消毒劑qacEΔ1基因陽性菌株的出現(xiàn)使醫(yī)院感染面臨新的挑戰(zhàn)。消毒劑的長(zhǎng)期不正確使用是導(dǎo)致該類菌株出現(xiàn)的主要原因，因此在使用消毒劑進(jìn)行消毒時(shí)，一定要保證消毒劑的有效濃度和足夠的消毒時(shí)間［6］。正確合理使用消毒劑是加強(qiáng)院內(nèi)感染控制的前提，在監(jiān)測(cè)到院內(nèi)多重耐藥菌上升的同時(shí)進(jìn)行qacEΔ1耐消毒劑基因的檢測(cè)，可為消毒劑的正確使用做出指導(dǎo)。

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2 Shiraishi T，Nakagawa Y.Review of disinfectant susceptibilty of bacteria isolated in hospital to commonly used disinfectants.Postgrad Med J，1993，69：S70－S77.

3 吳曉松，陳越英，談志，等.三種革蘭氏陰性桿菌耐消毒劑基因檢測(cè)及對(duì)苯扎溴銨抗性研究.中國(guó)消毒學(xué)雜志，2009，26：249－251.

4 何曉峰，劉芳，曹晉桂，等.多重耐藥革蘭氏陰性桿菌耐消毒劑基因 qacEΔ1 監(jiān)測(cè).中國(guó)感染控制雜志，2011，10：97－99.

5 黃支密，糜祖煌，石曉霞，等.醫(yī)院感染革蘭氏陰性桿菌耐消毒劑基因研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15：721－724.

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