王民，馬照雨，王瑩，劉建新，韓學(xué)哲

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨外科，西安，710061）

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，該病多發(fā)生在青少年中，臨床預(yù)后差。與其它惡性腫瘤一樣，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡平衡的破壞可促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。整合素αvβ3是細(xì)胞表面的重要黏附分子之一，在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞表面有高水平的表達(dá)。對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡有重要的調(diào)控作用；Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族的新成員，其選擇性地表達(dá)于多種常見的惡性腫瘤，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能[1]；Caspase-3被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡效應(yīng)期的中心分子，參與細(xì)胞的生理及病理性死亡過(guò)程[2]。目前，αvβ3，Survivin和Caspase-3在骨肉瘤中的表達(dá)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究30例骨肉瘤組織中αvβ3、Survivin和Caspase-3的表達(dá)情況并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料2002～2013年在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院30例骨肉瘤標(biāo)本及10例良性骨腫瘤標(biāo)本。所有患者均經(jīng)過(guò)臨床、病理、影像學(xué)三者結(jié)合確診。男17例，女13例，男女比例為1.3：1；年齡11～64歲，平均年齡20.95±9.47歲；股骨部位16例，脛排骨12例，其它部位2例；按Enneking外科分期Ⅰ期2例，ⅡA期7例，ⅡB期21例，Ⅲ期0。

1.2 試劑與儀器兔抗人整合素αvβ3多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Survivin和Caspase-3免抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。石蠟切片機(jī)購(gòu)自Thermo Shandon Ltd，型號(hào)為Finesse E。

1.3 免疫組化學(xué)染色組織經(jīng)固定、脫水后進(jìn)行石蠟包埋。石蠟切片機(jī)切10μm厚切片錨定到載玻片上。脫蠟水化后，3%H2O2去離子水孵育10Min，0.1%PBS洗滌2 min×3次。0.01 mmol構(gòu)椽酸鈉抗原修復(fù)液，微波爐內(nèi)98℃加熱10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS洗滌2 min×3次。加入一抗（抗αvβ3 1：500，抗Survivin 1：200，抗Caspase-3 1：200），4℃孵育過(guò)夜，次日復(fù)溫后PBS洗滌2 min×3次。加入抗兔IgG（1：200），37℃20 min，PBS洗滌2 min×3次。DAB顯色，沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4 療效判定每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野（X400）分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算染色陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占百分比，＜5%為陰性，＞5%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 αvβ3、Survivin和Caspase-3在骨肉瘤中的表達(dá)αvβ3（圖1.A，B）、Survivin（圖1.C，D）和Caspase-3（圖1.E，F(xiàn)）表達(dá)定位于包膜或胞漿。整合素αvβ3在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性率為70%（21/30），明顯高于骨纖維結(jié)構(gòu)不良對(duì)照組0%（P＜0.001）。Survivin在骨肉瘤組織中陽(yáng)性率為77%（23/30），在骨纖維結(jié)構(gòu)不良對(duì)照組陽(yáng)性率為10%（1/10）（P＜0.001）。Caspase-3在骨肉瘤組織中陽(yáng)性率為47%（14/30），明顯低于骨纖維結(jié)構(gòu)不良對(duì)照組90%（9/10）（P＜0.05）。

圖1 αvβ3、Survivin、Caspase-3在骨肉瘤和骨良性腫瘤組織中的表達(dá)A，C，E分別為αvβ3、Survivin、Caspase-3在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)；B，D分別顯示αvβ3和Survivin在骨良性腫瘤組織中的陰性表達(dá)表達(dá)，F(xiàn)顯示Caspase-3在骨良性腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)。Scale barin F=50μm。

2.2 αvβ3、Survivin、Caspase-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系將30例骨肉瘤組織標(biāo)本按Enneking分期分為Ⅰ～ⅡA和ⅡB～Ⅲ組，αvβ3、Survivin和Caspase-3的表達(dá)在兩組之間有顯著差異（P＜0.05）。而在不同年齡組、不同性別組及不同的發(fā)生部位組之間，αvβ3、Survivin和Caspase-3的表達(dá)無(wú)明顯差異。

表1αvβ3、Survivin、Caspase-3的表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

整合素[3]是細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體家族分子，是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)聯(lián)系的重要環(huán)節(jié)，可通過(guò)各種不同的信號(hào)途徑，把細(xì)胞外的信號(hào)傳入到細(xì)胞內(nèi)，然后再通過(guò)下游信號(hào)通路傳入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。整合素αvβ3又稱玻璃體結(jié)合蛋白受體。研究表明，αvβ3在組織內(nèi)的分布具有時(shí)相性和特異性，在成人血管、子宮平滑肌細(xì)胞等組織，αvβ3呈低水平表達(dá)，而在腫瘤新生血管及炎癥組織的新生內(nèi)皮細(xì)胞有高水平表達(dá)。一些浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞，如骨肉瘤、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等也有αvβ3的表達(dá)[4]。而使用整合素αvβ3的拮抗劑可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[5]。體外研究表明，抑制整合素αvβ3后，由血小板介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附性會(huì)明顯降低，表明在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中整合素也起著非常重要的作用。大量研究表明整合素αvβ3對(duì)腫瘤新生血管也具有促進(jìn)作用，通過(guò)抑制整合素可以明顯減少腫瘤新生血管的產(chǎn)生，因此整合素αvβ3被認(rèn)為是腫瘤治療的新的靶點(diǎn)[6]。目前臨床上采用的整合素αvβ3抑制劑雖然對(duì)某些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者可以起到抑制作用，有學(xué)者認(rèn)為這種作用是直接由于對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接抑制[10，11]。但目前還沒(méi)用明確的證據(jù)表明對(duì)其他類型的腫瘤也同樣有效[7-9]。因此整合素在腫瘤中的功能及作用仍需進(jìn)一步研究。Survivin選擇性表達(dá)于腫瘤組織，而在正常分化成熟的組織中無(wú)表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12]。在整合素αvβ3和Survivin促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖作用過(guò)程中，caspase-3均起到介導(dǎo)作用：αvβ3和Survivin有可能直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3來(lái)阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。

本研究對(duì)30例骨肉瘤和10例骨纖維結(jié)構(gòu)不良的研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤組織中整合素αvβ3和Survivin的陽(yáng)性率均高于良性骨腫瘤組織，而Caspase-3的陽(yáng)性率在骨肉瘤中則比良性腫瘤為低。提示整合素αvβ3和Survivin與Caspase-3相互作用促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程起到重要作用。進(jìn)一步對(duì)患者的臨床病例特征進(jìn)行分析標(biāo)明，αvβ3、Survivin和Caspase-3的表達(dá)僅與骨肉瘤Enneking外科分期相關(guān)，而在患者不同年齡組、不同性別組及不同的發(fā)生部位組之間，三者的表達(dá)無(wú)明顯差異。這一研究結(jié)果進(jìn)一步表明αvβ3、Survivin和Caspase-3可能參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

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