龍海 ，李芳榮，李一農(nóng)，凌杏園，謝泳桂，馮建軍，鄭耘，劉亮山

1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳 518001；2.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院 深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518045

檢測技術(shù)和方法是口岸植物線蟲檢測工作中的一個重要環(huán)節(jié)，關(guān)系到能否將檢疫性線蟲擋在國門之外，不會對我國的生態(tài)環(huán)境以及林業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等造成嚴(yán)重危害。目前口岸常用的線蟲檢測方法是形態(tài)學(xué)方法，有時也會結(jié)合一些基于PCR 的分子生物學(xué)方法。形態(tài)學(xué)方法要求檢測人員有豐富的形態(tài)學(xué)知識以及多年的檢測經(jīng)驗，而且對蟲態(tài)的要求比較嚴(yán)格，有時需要雌蟲才能鑒定，對于幼蟲往往無法鑒定。而基于PCR的分子生物學(xué)方法有時會有假陽性或假陰性的問題出現(xiàn)，如果要進(jìn)行測序，所需費用也比較高，周期也比較長。為了彌補(bǔ)上述兩種方法的不足，在滿足口岸快速通關(guān)要求的同時提高植物線蟲的檢測質(zhì)量，需要嘗試新的檢測技術(shù)和方法。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)的發(fā)展為植物線蟲檢測提供了新的手段。其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，而使生物分子電離，離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質(zhì)荷比（m/z）與離子的飛行時間成正比。MALDITOF MS 具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測試手段[1]。近年來，該技術(shù)逐漸被用于植物細(xì)菌、真菌和線蟲的檢測中。Stets 等[2]對小麥根部分離的細(xì)菌進(jìn)行了質(zhì)譜分析，能很好地區(qū)分這些細(xì)菌菌株。Horká等[3]應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對鏈核盤菌屬的4 個種進(jìn)行了鑒定，能準(zhǔn)確地將這4 種真菌區(qū)分開。Ahmad 等[4]利用MALDI-TOF MS 能很好地區(qū)分南方根結(jié)線蟲的單條幼蟲和雌蟲這兩種不同的蟲態(tài)，但樣品的前處理很難。Perera 等[5]利 用MALDI-TOF MS 技術(shù)成功地鑒定了小麥種癭線蟲，但是線蟲樣品用量大。

本研究提供了一種用于MALDI-TOF MS 檢測單條植物線蟲的方法，和已有方法相比，該方法對于線蟲的前處理容易操作，所需樣品量少，具有結(jié)果穩(wěn)定、背景信號低、靈敏度高等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

本研究所用樣品系香港入境旅檢時被截獲，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為短體線蟲（Pratylenchusspp）。將分離到的短體線蟲轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf 管中，輕微渦旋5 min，4000 r/min離心10 min，去上清液；加入1 mL 滅菌水，輕微渦旋5 min，4000 r/min 離心10 min，去上清液，此步驟重復(fù)3次[4]。

如果分離到的線蟲量少，可以滴加3 滴滅菌水到載玻片上，挑取單條線蟲到第一滴水中清洗，再挑到第二滴水中清洗，最后挑到第三滴水中清洗。

1.2 其他材料

溶劑乙腈、甲酸、三氟乙酸（TFA）為色譜純，購自Sigma 公司；標(biāo)準(zhǔn)品Peptide Calibration Standard、Protein Calibration StandardⅠ和基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）購自Burker公司；質(zhì)譜儀為Burker公司的MALDI-TOF-microflex。

1.3 基質(zhì)溶液配制

乙腈、水和10% TFA 按體積比2∶1∶1 混合，加入CHCA至過飽和?；|(zhì)溶液須現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

取990 μL 50%乙腈與10 μL 10% TFA 混勻，取125 μL 混合液加至1 管Peptide Calibration Standard 中，混勻；取125 μL 混合液加至1 管Protein Calibration StandardⅠ中，混勻；從上述2 管中各取等體積的溶液混勻配制成蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，用30%的乙腈按1/5 稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，分裝至滅菌PCR 管中，每管5 μL，-20℃保存。

1.5 樣品前處理及加樣

載玻片上滴加5 μL 70%甲酸和乙腈的等體積混合液；在體視顯微鏡下挑取一條清洗好的線蟲，轉(zhuǎn)移到載玻片的混合液中，壓破線蟲；用移液槍吸取1.5 μL 混合液（連帶線蟲一起），滴加到MALDITOF MS 樣品板上；取1 μL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品滴加到MALDI-TOF MS 樣品板上；溶液晾干后加1 μL CHCA基質(zhì)溶液；晾干后備用，每個樣品重復(fù)3次。

1.6 質(zhì)譜分析

采用波長337 nm的氮激光源，線性陽離子檢測模式，20 000 V 加速電壓，延遲時間400 ns，激光強(qiáng)度2200，每個樣品點激光隨機(jī)射擊60 個點，每次射擊100 次。m/z 采集范圍2000～20 000 D，使用標(biāo)準(zhǔn)品對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)并作為陽性參照物。每個樣品的3個質(zhì)譜圖疊加后作為樣品的質(zhì)譜圖。

2 結(jié)果

采用MALDI-TOF MS 對單條短體線蟲的雌蟲和二齡幼蟲（J2）分別進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示（圖1），經(jīng)過清洗和前處理，短體線蟲的雌蟲和J2 的質(zhì)譜圖都出現(xiàn)了較多的離子峰，圖譜基線平滑。雌蟲穩(wěn)定重復(fù)出現(xiàn)的質(zhì)譜峰值分別為m/z 2790、2970、3326、4373、4872、5654、7000、9579 和19161，J2 穩(wěn)定重復(fù)出現(xiàn)的質(zhì)譜峰值分別為m/z 2185、2790、3036、3326、4063、4373、4929、5380、6999 和11156。對比雌蟲和J2 的質(zhì)譜峰值，在±0.1%的誤差范圍內(nèi)，相同的峰值分別為m/z 2790、4373 和7000，其余峰值分別為各自的特征峰。從結(jié)果可以看出，MALDI-TOF MS 能夠區(qū)分出短體線蟲的不同蟲態(tài)。

3 討論

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法結(jié)合PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法，是目前口岸植物線蟲檢疫常用的方法。這種方法有時滿足不了口岸“檢得出、檢得準(zhǔn)、檢得快”的要求。形態(tài)學(xué)方法難以鑒定幼蟲，分子生物學(xué)方法有時會產(chǎn)生假陽性或假陰性，如果要測序，會延長檢測周期。MALDI-TOF MS 具有快速、靈敏度高、分辨率高、準(zhǔn)確度高等特點，目前國際上有兩家實驗室用該方法檢測植物線蟲[4-5]。Perera 等[5]用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了大量小麥種癭線蟲，給出了鑒定的特征峰。Ahmad 人[4]對南方根結(jié)線蟲的單條幼蟲和雌蟲進(jìn)行了質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)它們有一個相同的質(zhì)譜峰，雌蟲有4個特征峰，幼蟲有7個特征峰。這兩個實驗證明MALDI-TOF MS 能夠用于植物線蟲種的鑒定，以及區(qū)分種內(nèi)不同的蟲態(tài)。

圖1 單條短體線蟲的蛋白質(zhì)指紋圖譜

在植物線蟲檢疫工作中截獲的線蟲量較少，往往只能對單條線蟲進(jìn)行檢測。在實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，Ahmad[4]處理單條線蟲的方法難以操作，很難把單條線蟲直接挑到MALDI-TOF MS 樣品板上。因此，我們對單條線蟲的前處理和加樣方法進(jìn)行了改進(jìn)，提高了蛋白的提取效率，得到比較好的結(jié)果，圖譜基線平滑，離子峰較多，特征峰明顯。MALDI-TOF MS檢測植物線蟲耗時短，從樣品清洗到得出結(jié)果不超過2 h；檢測靈敏度高，能夠檢測單條線蟲；結(jié)果穩(wěn)定性好，多次重復(fù)試驗的結(jié)果復(fù)現(xiàn)性好。缺點是前期投入大，儀器較昂貴；鑒定植物線蟲需要建立相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，目前植物線蟲的數(shù)據(jù)庫比較缺乏。但是，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷成熟、儀器成本的降低、相關(guān)數(shù)據(jù)庫的不斷完善，不久的將來MALDI-TOF MS 將會像PCR技術(shù)一樣有望成為植物線蟲鑒定的利器。

[1]馮建軍,龍海,劉新嬌,等.MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)鑒定植物病原體研究進(jìn)展[J].植物檢疫,2014,28(6):13-18.

[2]Stets M I,Pinto A S,Huergo L F,et al.Rapid identification of bacterial isolates from wheat roots by high resolution whole cell MALDI-TOF MS analysis[J].J Biotechnol,2013,165(3-4):167-174.

[3]Horká M,Kubesová A,Salplachta J,et al.Capillary and gel electromigration techniques and MALDI-TOF MS-suitable tools for identification of filamentous fungi[J].Anal Chim Acta,2012,716:155-162.

[4]Ahmad F,Gopal J,Wu H F.Rapid and highly sensitive detection of single nematode via direct MALDI mass spectrometry[J].Talanta,2012,93:182-185.

[5]Perera M R,Vanstone V A,Jones M G.A novel approach to identify plant parasitic nematodes using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19:1454-1460.