王禮強，楊瑞，袁伯川，劉春生，劉穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102

甘草是我國最常用的大宗藥材之一，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和諸藥等作用[1]。根據(jù)《中華人民共和國藥典》的規(guī)定[2]，藥材甘草有3 個基原，即烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）、光果甘草（G.glabraL.）和脹果甘草（G.inflataBat.）。目前，有關(guān)甘草的研究多集中于烏拉爾甘草，涉及功能基因克隆、異源表達、化學(xué)成分分析等諸多方面[3-6]，對光果甘草的研究則相對較少。雖然烏拉爾甘草與光果甘草同為藥材甘草的基原植物，其化學(xué)成分及相應(yīng)的藥理活性卻具有較大的差異[7-8]，因此對于光果甘草的研究也須提上日程。

目前野生甘草資源日趨匱乏，且存在藥效成分不穩(wěn)定及種子市場混亂等現(xiàn)象，因此栽培甘草已經(jīng)成為主流商品。但栽培甘草普遍存在品質(zhì)退化及甘草酸含量低等問題，難以達到我國藥典和日本藥典規(guī)定的合格標(biāo)準(zhǔn)。因此，通過現(xiàn)代生物技術(shù)對甘草進行遺傳改良，提高栽培甘草的質(zhì)量，對于甘草資源的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化研究中十分理想的材料，一方面可以有目的地向原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)入特定基因，改良植物的性狀；另一方面，在原生質(zhì)體再生植株的過程中較易發(fā)生無性系變異，對其進行人工理化誘導(dǎo)，則可選育出有利用價值的突變體植株[9]；此外，通過原生質(zhì)體融合還可以克服遠緣雜交的不親和障礙，獲得有價值的雜種后代[10]。因此，甘草原生質(zhì)體的分離可以為進一步的遺傳轉(zhuǎn)化及體細胞雜交奠定基礎(chǔ)。目前，有關(guān)甘草原生質(zhì)體分離的報道僅見烏拉爾甘草分離條件的相關(guān)研究[11]，光果甘草尚未見同類報道。

我們以光果甘草為研究對象，從多個方面對其原生質(zhì)體的分離進行探討，并確定了最優(yōu)分離條件，以期為光果甘草原生質(zhì)體培養(yǎng)以及在此基礎(chǔ)上的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供大量優(yōu)質(zhì)的原生質(zhì)體材料來源。

1 材料和方法

1.1 材料

生長7 d 的光果甘草無菌苗的葉片及胚軸部分由本實驗制備。纖維素酶（Onozuka R-10）、果膠酶（Yakult Y-23）、離析酶（Yakult R-10）及KH2PO4、KNO3、MgSO4·7H2O、KI、無水CaCl2、CuSO4·5H2O、甘露醇等化學(xué)試劑（分析純）購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Olympus 普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡；哈東聯(lián)超凈工作臺；Anke TGL-16G 離心機；Eppendorf微量移液器。

1.2 不同酶液組合及供試材料對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

用于原生質(zhì)體分離的酶液組合見表1，各處理均用CPW-13%甘露醇溶液配制，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。

無菌條件下取生長7 d 的光果甘草無菌苗的子葉和胚軸，準(zhǔn)確稱取子葉及胚軸100 mg 至無菌1.5 mL 離心管中（各27 份，每種酶液組合3 個重復(fù)），按照10∶1 的比例加入表1 中各酶液，用Parafilm 封口；25℃黑暗恒溫培養(yǎng)箱中靜置酶解12 h，60 目細胞篩網(wǎng)過濾，用5 mL CPW-13%甘露醇溶液洗滌；將濾液收集于15 mL 離心管中，1200 r/min 離心10 min；棄上清，將沉淀用8 mL CPW-25%蔗糖溶液懸浮后，沿管壁緩慢在蔗糖層上加入2 mL CPW-13%甘露醇溶液，800 r/min 離心10 min；小心吸取界面上的原生質(zhì)體懸浮液，置于另一離心管中，加入5 mL CPW-13%甘露醇溶液，1200 r/min 離心10 min；收集沉淀，溶于1 mL MS 液體培養(yǎng)基中；臺盼藍染色；用血球計數(shù)板分別計數(shù)死、活細胞；計算原生質(zhì)體活力及產(chǎn)量。

表1 光果甘草原生質(zhì)體分離所用各酶液組合

1.3 不同酶解時間及酶解方式對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

25℃條件下，采用表1中的5號酶液，對生長7 d的光果甘草無菌苗的子葉進行酶解，設(shè)置6、8、10、12、14、16 h 共6 種酶解時間，靜置酶解及40 r/min振動2種酶解方式，各處理分別進行3個重復(fù)。其他實驗步驟同1.2。

1.4 不同低溫預(yù)處理方法對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

25℃條件下，采用表1中的5號酶液，對生長7 d的光果甘草無菌苗的子葉進行酶解，設(shè)置5 種低溫預(yù)處理條件，即4℃預(yù)培養(yǎng)4、8、12、18、24 h，以未進行低溫預(yù)處理的甘草外植體作為對照組，每處理各進行3個重復(fù)，靜置條件下酶解14 h，其他實驗步驟同1.2。

1.5 不同滲透壓對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

以生長7 d 的光果甘草無菌苗的子葉作為實驗材料，設(shè)置6 種滲透壓條件，即甘露醇0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8 mol/L，分別用含有以上濃度甘露醇的CPW 溶液配制表1 中的5 號酶液，并作為實驗用酶液，每種酶液各進行3 個重復(fù)，靜置條件下酶解14 h，其他實驗步驟同1.2。

1.6 光果甘草原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的計算方法

采用臺盼藍染色方法鑒別原生質(zhì)體的死活，死亡的原生質(zhì)體著色，而生活的原生質(zhì)體不著色。

原生質(zhì)體活力=活的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)

原生質(zhì)體密度（1 mL原生質(zhì)體懸液中的原生質(zhì)體個數(shù)）=4個大格中的原生質(zhì)體數(shù)×104/4

因為本實驗中每種不同的處理均稱取了100 mg 實驗材料，所以當(dāng)以每鮮克重（gfw）的原生質(zhì)體數(shù)目為單位表示原生質(zhì)體產(chǎn)量時，計算方法如下：

原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/gfw）=原生質(zhì)體密度×10

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶液組合及供試材料對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

如表2 所示，就原生質(zhì)體產(chǎn)量而言，以子葉作為實驗材料要顯著高于以胚軸作為實驗材料，其倍數(shù)從幾倍至十幾倍不等，因此子葉是分離光果甘草原生質(zhì)體的最佳實驗材料。就分離效果而言，3、5 及8號酶液的分離效果均較好，但3 號酶液原生質(zhì)體活力僅為56.32%，8 號酶液原生質(zhì)體產(chǎn)量僅為11.98×105個/gfw。綜合考慮原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力兩個方面的因素，確定了5 號酶液，即1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶的組合為最佳酶液組合。

2.2 不同酶解時間及酶解方式對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

如表3 所示，在靜置條件下，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時間的延長呈先上升后下降的趨勢，以6 h 酶解所獲得的原生質(zhì)體最少，為2.06×105個/gfw，14 h酶解所獲得的原生質(zhì)體達到頂峰，為30.77×105個/gfw，而酶解時間繼續(xù)延長到16 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量則略有下降，為23.98×105個/gfw。就原生質(zhì)體活力而言，除6 h樣本外，也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，以8 h酶解活力最低，為54.0%，14 h 時活力最高，為66.9%，繼續(xù)延長酶解時間至16 h，原生質(zhì)體活力會顯著下降至只有38.9%，這也證明了太長的酶解時間可能會導(dǎo)致原生質(zhì)體的破壞，從而降低其活力。

采用40 r/min 緩慢振蕩的酶解方式，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時間的延長逐漸上升，當(dāng)酶解時間為12 h時達到最高值，即45.10×105個/gfw，但當(dāng)酶解時間繼續(xù)延長時，原生質(zhì)體產(chǎn)量不再升高，反而開始下降。就原生質(zhì)體活力而言，除酶解6 h 之外，在其他酶解時間，原生質(zhì)體活力均較為接近，但均較靜置酶解方式原生質(zhì)體活力低，僅為靜置酶解原生質(zhì)體活力的約2/3。

因此，綜合考慮原生質(zhì)體活力及產(chǎn)量兩個方面的因素，認(rèn)為靜置酶解14 h的方式較為適宜。

2.3 不同低溫預(yù)處理方法對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

如表4 所示，隨著4℃預(yù)培養(yǎng)時間的延長，光果甘草原生質(zhì)體活力及產(chǎn)量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，到12 h 時達到最高值，但繼續(xù)延長低溫預(yù)培養(yǎng)的時間，原生質(zhì)體的活力和產(chǎn)量不再上升，反而開始下降，24 h 時活力已不足50%。而未進行低溫預(yù)培養(yǎng)時，原生質(zhì)體活力較低溫預(yù)培養(yǎng)8、12 h 時的活力低，但在產(chǎn)量方面，未低溫預(yù)培養(yǎng)實驗組的原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，僅低于4℃預(yù)培養(yǎng)12 h 實驗組。綜上，4℃預(yù)培養(yǎng)12 h 有利于提高光果甘草原生質(zhì)體的活力和產(chǎn)量。

表2 酶液成分及供試材料對光果甘草原生質(zhì)體分離效果的影響

表3 不同酶解時間及酶解方式對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

2.4 不同滲透壓對光果甘草原生質(zhì)體分離的影響

如表5 所示，隨著甘露醇濃度的升高，光果甘草原生質(zhì)體的活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)甘露醇濃度為0.7 mol/L 時達到最大值，即63.7%，此后，甘露醇濃度繼續(xù)升高，光果甘草原生質(zhì)體的活力開始下降。就原生質(zhì)體產(chǎn)量而言，隨著甘露醇濃度的升高，也基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢，產(chǎn)量最高值也出現(xiàn)在甘露醇濃度為0.7 mol/L 時，為28.37×105個/gfw。綜上，在對光果甘草進行原生質(zhì)體分離時，最佳甘露醇使用濃度為0.7 mol/L，太低及太高的甘露醇濃度均難以達到良好的滲透穩(wěn)定作用。

2.5 小結(jié)

我們從材料來源、酶液組成、酶解方式、酶解時間、滲透壓、預(yù)處理方式等6 個方面對光果甘草原生質(zhì)體的分離進行了研究，并確定了最優(yōu)化的分離條件，即：以生長7 d 的光果甘草無菌苗的葉片作為分離原生質(zhì)體的外植體材料，在4℃條件下于MS 基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)12 h，以1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶作為分離原生質(zhì)體所用酶液，以含0.7 mol/L 甘露醇作為滲透保護劑的CPW 溶液配制酶液，25℃條件下靜置酶解14 h。以此條件獲得的光果甘草原生質(zhì)體完整、透明，質(zhì)量良好。本實驗結(jié)果將為光果甘草原生質(zhì)體融合及遺傳轉(zhuǎn)化奠定良好的基礎(chǔ)。

表4 低溫預(yù)處理對甘草原生質(zhì)體分離的影響

表5 不同滲透壓對甘草原生質(zhì)體分離的影響

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