李婷，王安平，李萍，王雙雙，母義明

解放軍總醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100853

白血病相關(guān)蛋白16（leukemia related protein 16，LRP16）基因是韓為東等于1999年從正常人外周血淋巴細(xì)胞中克隆并命名的一個基因，屬于Macro Domain 家族。該基因定位于染色體11q12.23，含11個外顯子，編碼325 個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白[1-2]。我們前期的研究表明，LRP16 基因?qū)σ葝u素分泌和胰島素抵抗均有影響。它在脂肪細(xì)胞3T3-L1、肌肉細(xì)胞C2-C12、肝癌細(xì)胞HepG2 中發(fā)揮著重要作用，LRP16 過表達(dá)可上調(diào)多種炎性因子（TNF-α、IL-6）的表達(dá)，損傷IRS-1 信號傳導(dǎo)通路（降低pIRS-1、PI3-K、pAkt 的表達(dá)），抑制細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，引起外周胰島素抵抗[3-5]。在這些研究中我們采用的是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式，這一技術(shù)一方面只能達(dá)到短期轉(zhuǎn)染，另一方面轉(zhuǎn)染效率較低。我們想深入研究LRP16 促進胰島素抵抗的分子機制，希望獲得長期穩(wěn)定的LRP16 過表達(dá)細(xì)胞株。因此，我們構(gòu)建了LRP16 過表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，且成功地感染了HepG2 細(xì)胞，獲得穩(wěn)定過表達(dá)LRP16 的細(xì)胞株，為深入研究LRP16 抑制肝臟胰島素抵抗的相關(guān)機制提供相關(guān)技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 包裝細(xì)胞及人肝癌HepG2 細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和細(xì)胞資源中心（CRC/PUMC）；過表達(dá)質(zhì)粒載體EX-Y2069-Lv201 及對照質(zhì)粒載體EX-NEG-Lv201（表1，圖1）由OmicsLink 公司構(gòu)建；慢病毒包裝試劑盒Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit、Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定試劑盒、第一鏈cDNA 合成試劑盒、2×All-in-One qPCR Mix 均購自Gene Copoeia 公司；MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗均購自Gibco 公司；TRIzol 購自Invitrogen 公司；蛋白marker 購自Thermo公司；Western 印跡發(fā)光試劑盒購自北京普利萊公司；鼠抗人β-actin抗體購自Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司；qPCR 引物由Invitrogen 公司合成；LRP16抗體由本實驗室制備保存。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

選用25 mL 培養(yǎng)瓶，適量HepG2 細(xì)胞，加入5 mL MEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1 μmol/L 丙酮酸鈉），于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液一次，4～5 d傳代一次。

1.3 質(zhì)粒載體構(gòu)建及鑒定

對構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒載體EX-Y2069-Lv201 的LRP16 開放讀框（ORF）進行測序，結(jié)果與人類LRP16基因（GenBank：NM_014067）序列相符。

1.4 慢病毒包裝

按照Lenti-Pac HIV Expression 慢病毒包裝試劑盒進行下述操作。在轉(zhuǎn)染前2 d，按每個10 cm的培養(yǎng)皿1.3×106～1.5×106細(xì)胞數(shù)將HEK293T 包裝細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到70%～80%的密度；在去聚丙烯的試管中，取2.5 μg 病毒過表達(dá)質(zhì)粒EX-Y2069-Lv201 和5.0 μL（0.5 μg/μL）Lenti-Pac HIV mix 稀釋至200 μL 的Opti-MEM 內(nèi)；取15 μL EndoFectin Lenti，在另一試管中用Opti-MEM 稀釋至終體積為200 μL；將稀釋的EndoFectin Lenti 反應(yīng)物加入輕微渦旋含DNA 的試管中（添加順序不可顛倒），然后將上述混合物轉(zhuǎn)移到5 mL 圓底聚丙烯試管Falcon 中；把形成的DNA-EndoFectin 復(fù)合物直接加入培養(yǎng)皿，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使復(fù)合物均勻分布；在37℃、5% CO2孵箱中孵育細(xì)胞過夜（8～14 h），用含2%～5%經(jīng)熱失活的胎牛血清和青霉素、鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基替換過夜的原培養(yǎng)基；加入1/500 體積的TiterBoost 反應(yīng)物到培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)孵育；經(jīng)48 h轉(zhuǎn)染，收集含假病毒的培養(yǎng)液到加蓋的試管中，500 r/min 離心10 min 去除細(xì)胞碎片；進一步離心，用0.45 μm 孔徑的濾器過濾HEK293T 細(xì)胞上清液，得到過表達(dá)病毒濃縮液LPP-Y2069-Lv201-400，分裝小管放置于-80℃?zhèn)溆?。同樣步驟得到對照病毒濃縮液LPP-NEG-Lv201-100。

表1 載體克隆信息

圖1 過表達(dá)質(zhì)粒載體EX-Y2069-Lv201（A）及對照質(zhì)粒載體EX-NEG-Lv201（B）信息

1.5 慢病毒滴度測定

HEK293T 細(xì)胞傳代，24 孔板中每孔加入1×105細(xì)胞，體積為500 μL；次日準(zhǔn)備10 支無菌Ep 管，每管加入90 μL 培養(yǎng)基，取待測病毒原液10 μL 加入第1 支管中，混合均勻，取混合均勻的第1 管液10 μL 加入第2 支管中，繼續(xù)相同操作直到最后一管；選取所需細(xì)胞孔，吸去90 μL培養(yǎng)基，加入稀釋好的病毒溶液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1 d后，加入新鮮培養(yǎng)基500 μL；小心操作；4 d 后抽提RNA，然后采用Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定試劑盒提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量PCR檢測綠色熒光蛋白標(biāo)記的慢病毒滴度。病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6 TU/μL，亦即2E+9 TU/mL。確保病毒滴度≥108TU/mL（LPP-Y2069-Lv201-400 為3.87×108TU/mL，LPP-NEG-Lv201-100 為6.25×108TU/mL），以便后續(xù)操作。

1.6 慢病毒載體感染HepG2細(xì)胞系

將HepG2 細(xì)胞計數(shù)后鋪到6 孔板中培養(yǎng)，各孔加入2 mL MEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素，1 μmol/L 丙酮酸鈉），在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；鋪板24 h 后，按照MOI=30，每孔加入相應(yīng)目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和對照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100，混勻后于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；感染48 h 后，觀察慢病毒侵染結(jié)果，拍攝細(xì)胞熒光圖片；用胰酶消化感染過的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至6 孔板（每塊6 孔板對應(yīng)一種慢病毒，留出1 孔用于陰性對照細(xì)胞），以含1 μg/mL 嘌呤霉素的MEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素，1 μmol/L 丙酮酸鈉）進行藥物篩選培養(yǎng)5～7 d，觀察細(xì)胞存活情況和熒光圖片，當(dāng)細(xì)胞熒光圖片與明場細(xì)胞相對應(yīng)，則嘌呤霉素濃度可以減半進行培養(yǎng)；連續(xù)加藥培養(yǎng)7 d后，嘌呤霉素濃度減半至0.5 μg/mL 繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后收取細(xì)胞。

1.7 qPCR檢測LRP16的mRNA表達(dá)

從細(xì)胞中提取RNA，定量，電泳確定其純度。用第一鏈cDNA 合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，用Gene Copoeia 公司試劑盒配置所推薦的反應(yīng)體系后在PRISM 7300（ABI 公司）上進行qPCR 反應(yīng)。根據(jù)LRP16 的基因序列設(shè)計PCR 引物（上游引物：5'-A GCTCTTTCACTCGGAGGATT-3'；下游引物：5'-TG GCAAAAGAAGAAGACAAAGC-3'）。以GAPDH 基因為內(nèi)參，根據(jù)GAPDH 的基因序列設(shè)計PCR 引物（上游引物：5'-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3'；下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'）。反應(yīng)條件：95℃ 30 s 預(yù)變性；95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃10 s，40 個循環(huán)。目標(biāo)基因mRNA 的相對含量通過ΔΔCt計算方法獲得。

1.8 Western印跡檢測LRP16的表達(dá)

用自制IP 緩沖液（0.15 mol/L NaC1，20 mmol/L Tris-HC1，10%甘油，0.1% NP-40）加入25×總蛋白酶抑制劑及用100×PMSF 配置的細(xì)胞裂解液，分別裂解過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株和野生型（未轉(zhuǎn)染）HepG2 細(xì)胞，4℃、12 000 r/min 離心后取上清作為樣品，測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品進行SDSPAGE 后轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF 膜，用以TBST 液配制的5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，LRP16 鼠抗以1∶200稀釋，β-actin 鼠抗人以1∶1000 稀釋，4℃反應(yīng)過夜，用TBST 液洗膜3 次，每次15 min，二抗以1∶5000 稀釋，室溫反應(yīng)1 h，用TBST液洗膜3次，每次15 min，在膜上滴加發(fā)光液后進行曝光。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體感染HepG2細(xì)胞株的篩選

按前述方法將HepG2 細(xì)胞計數(shù)后鋪到6 孔板中培養(yǎng)，每孔加入目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和對照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100，感染48 h 后，觀察慢病毒侵染結(jié)果，拍攝細(xì)胞熒光圖片（圖2）?？梢钥闯?，轉(zhuǎn)入LPP-Y2069-Lv201-400 和LPP-NEG-Lv201-100 慢病毒后的HepG2 細(xì)胞，其綠色熒光蛋白表達(dá)超過90%。

2.2 過表達(dá)慢病毒感染HepG2 細(xì)胞后對LRP16 基因表達(dá)的影響

提取過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株和野生型（未轉(zhuǎn)染）HepG2 細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞的LRP16 相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株LPP-Y2069-Lv201-400 中LRP16 目的基因的表達(dá)量為對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株LPP-NEG-Lv201-100 的128.64倍（表2）。

2.3 HepG2 細(xì)胞的感染和Western 印跡分析LRP16蛋白的過表達(dá)效果

將獲得的LRP16 基因過表達(dá)的HepG2 細(xì)胞、過表達(dá)對照細(xì)胞及野生型HepG2 細(xì)胞分別培養(yǎng)4～5 d，在培養(yǎng)皿中加入適量細(xì)胞裂解液提取蛋白，用上清液行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后進行蛋白免疫印跡分析。結(jié)果顯示空白組和對照組細(xì)胞在相對分子質(zhì)量約28×103處均出現(xiàn)了微弱條帶，而過表達(dá)組出現(xiàn)明顯的粗黑條帶，表明過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株LPP-Y2069-Lv201-400 的LRP16 表達(dá)量明顯高于對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株LP-NEG-Lv201-100和野生型HepG2（圖3），結(jié)果與實時熒光定量PCR一致。

表2 qPCR檢測過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株、對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株及野生型HepG2細(xì)胞中LRP16 mRNA水平

圖2 LRP16過表達(dá)穩(wěn)定株（A）及對照穩(wěn)定株（B）熒光轉(zhuǎn)染情況

圖3 Western印跡檢測LRP16蛋白表達(dá)的差異

3 討論

前期，我們做了大量LRP16相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)它是機體發(fā)育過程中不可或缺的一個基因，其表達(dá)不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]，也參與了胰島素的分泌及胰島素外周器官的胰島素抵抗作用。

隨著糖尿病發(fā)生率的上升，胰島素抵抗一度成為近年的研究熱點，胰島素通路受到重視。而我們發(fā)現(xiàn)的LRP16 基因參與胰島素抵抗立刻引起了關(guān)注。但目前我們的發(fā)現(xiàn)大多停留在表明現(xiàn)象，真正所涉及到的機制研究甚少。

因為肝臟是胰島素發(fā)揮作用的重要外周器官，而且之前我們也曾在肝癌HepG2 細(xì)胞系中研究過LRP16的作用，所以，在深入研究LRP16基因?qū)σ葝u素信號通路的影響機制時，我們?nèi)匀贿x用這一常用的肝癌細(xì)胞系。此LRP16 基因過表達(dá)的HepG2 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立，為我們今后的研究提供了一個長期有效的研究工具。

[1]韓衛(wèi)東,于力,樓方定,等.一個新的白血病相關(guān)基因LRP16全長cDNA 的克隆、序列分析及表達(dá)特征[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2001,17(2):209-204.

[2]于力,韓衛(wèi)東,樓方定,等.新的白血病相關(guān)基因LRP16 的克隆[J].軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報,2000,21(2):81-84.

[3]臧麗,呂朝暉,汪保安,等.LRP16 通過下調(diào)PPARγ表達(dá)抑制細(xì)胞葡萄糖攝取[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2010,26(3):217-220.

[4]臧麗,母義明,呂朝暉,等.LRP16基因抑制IRS-1信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體γ轉(zhuǎn)錄活性導(dǎo)致C2-C12 成肌細(xì)胞胰島素抵抗[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91(20):1408-1412.

[5]臧麗,母義明,呂朝暉,等.人白血病相關(guān)蛋白16 基因?qū)?T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取及過氧化物酶體增殖物激活受體γ活性的影響[J].中國糖尿病雜志,2011,19(4):293-297.

[6]Meng Y G,Han W D,Zhao Y L,et al.Induction of the LRP16 gene by estrogen promotes the invasive growth of Ishikawa human endometrial cancer cells through the downregulation of E-cadherin[J].Cell Res,2007,17:869-880.

[7]Tian L Y,Wu Z Q,Zhao Y L,et al.Differential induction of LRP16 by liganded and unliganded estrogen receptor alpha in SKOV3 ovarian carcinoma cells[J].J Endocrinol,2009,202:167-177.