李劍 吳文育 陳淑君 傅雯雯 徐金華 Taro Uyama 徐昱 項蕾紅

帶黑素細胞的組織工程化表皮膜片移植治療白癜風的初步臨床研究

李劍 吳文育 陳淑君 傅雯雯 徐金華 Taro Uyama 徐昱 項蕾紅

目的 評估體外培養(yǎng)含黑素細胞自體表皮膜片移植技術(shù)治療穩(wěn)定期白癜風的臨床有效性和安全性。方法 18～65歲皮膚科門診穩(wěn)定期白癜風患者，切取患者3～7.5 cm2正常皮膚組織，根據(jù)Green方法進行表皮組織片培養(yǎng)，約3周角質(zhì)形成細胞形成具有一定張力的表皮片組織，即進行手術(shù)移植；術(shù)后患處加壓包扎，2周后拆線，術(shù)后進行隨訪，并用Wood燈分析色素恢復情況，記錄復色情況及不良反應，評價治療效果。結(jié)果2012年2-12月共入組患者15例，年齡18～62歲，隨訪時間12～24個月，失訪1例。15例白癜風患者中6例達到100%復色，且均為節(jié)段型白癜風，6例達到75%～100%復色。面頸部患者復色效果優(yōu)于軀干部位。結(jié)論體外培養(yǎng)含黑素細胞的自體組織工程化表皮膜片移植技術(shù)用于治療穩(wěn)定期白癜風的安全性、有效性都較高，值得臨床應用。

白癜風；黑素細胞；組織工程；移植，自體；器官培養(yǎng)技術(shù)；修復外科手術(shù)；皮膚移植

白癜風外科手術(shù)方法主要包括手術(shù)切除（含皮膚擴張、皮瓣轉(zhuǎn)移）、皮膚磨削和自體皮膚移植。手術(shù)切除和磨削針對小面積的白癜風患者，但是對于皮損面積較大的患者，自體皮膚移植是較為理想的方法。自體皮膚移植分為三類：含黑素細胞的正常皮膚（表皮或表皮和真皮）移植；非培養(yǎng)的含有黑素細胞的表皮或者毛囊移植；生長于附著物的培養(yǎng)的黑素細胞（含有或者不含有角質(zhì)形成細胞）移植。有學者對自體培養(yǎng)黑素細胞治療白癜風進行了深入研究，取得了較好的臨床效果［1-2］。近年來我國學者在構(gòu)建組織工程皮膚領域取得了矚目的成績［3-4］。2011年底，我科開始進行體外培養(yǎng)組織工程化表皮膜片移植治療白癜風的探索，取得了較好的治療效果?，F(xiàn)將前期治療且隨訪時間較長的白癜風患者治療恢復情況總結(jié)如下。

對象與方法

一、病例納入標準

2012年2-12月于華山醫(yī)院皮膚科就診、臨床診斷為穩(wěn)定期白癜風患者（患者無新發(fā)皮損，原有皮損無擴大，無同形反應至少1年）。年齡18～65歲，無嚴重內(nèi)科疾病及活動性傳染病，無瘢痕體質(zhì)，術(shù)前經(jīng)多種方法治療無效，并有意愿進行手術(shù)治療。術(shù)前查血常規(guī)、出凝血功能、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗及心電圖等，排除系統(tǒng)性疾病及傳染性疾病，實驗室檢查正常適合手術(shù)者進行手術(shù)治療。本研究經(jīng)華山醫(yī)院倫理委員會批準，患者術(shù)前簽署知情同意書。

二、表皮培養(yǎng)及手術(shù)方法

1.表皮組織培養(yǎng)：培養(yǎng)方法同以往研究報道［5］?；颊呔植拷櫬樽?，從下腹部腹股溝處切?。?～1.5）cm×（3～4）cm的正常全層皮膚組織，0.25%胰酶/0.01%EDTA和膠原蛋白酶對皮膚組織進行處理并回收；將回收的表皮細胞接種在用絲裂霉素處理過的不能增殖的滋養(yǎng)細胞層3T3上培養(yǎng)；每2～3 d更換1次DMEM-F12培養(yǎng)液，DMEM-F12培養(yǎng)液由 DMEM（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，加拿大Invitrogen公司）和Ham（Ham′s F12 medium，加拿大Invitrogen公司）3∶1組成，其中添加5%胎牛血清（美國HyClone公司），10μg/L表皮生長因子（美國Austral Biologicals公司），24.3 mg/L腺嘌呤（美國Sigma Chemicals公司），5 mg/L胰島素（美國Sigma Chemicals公司），0.4 mg/L氫化可的松（美國Calbiochem公司），0.212 mg/L異丙基去甲腎上腺素（加拿大Sandoz公司）。表皮細胞在7～10 d后結(jié)成細胞群落，2周左右，表皮細胞融合狀態(tài)形成后，再培養(yǎng)1周，形成完整的復層表皮細胞（圖1）。用倒置顯微鏡觀察和多巴染色法來確認培養(yǎng)的表皮中黑素細胞的生長情況及比例。培養(yǎng)中及移植手術(shù)前1周對培養(yǎng)的表皮進行細菌、真菌、支原體、衣原體和內(nèi)毒素檢測。

2.手術(shù)方法：移植當天，用紗布將培養(yǎng)成形的表皮從培養(yǎng)皿中剝離，用磷酸緩沖溶液洗凈以備移植用；患者皮損處用1%利多卡因、1%腎上腺素局部麻醉后，用電動皮膚磨削機對患處皮膚表層磨削。將培養(yǎng)表皮的基底膜面著磨削區(qū)域覆蓋；將涂有抗菌藥軟膏的油紗布（非粘貼性紗布）覆蓋于移植部位后進行固定縫合；用紗布固定，以防止手術(shù)部位被拉動。移植1周后，替換保護用固定紗布；移植2周后，拆線移除非粘貼性紗布，用涂了抗菌素軟膏的紗布覆蓋2～3 d后移除紗布，此后每天輕涂抗菌藥軟膏2次，避免陽光曝曬。移植后的第1、3、6、12個月隨訪觀察，數(shù)碼相機拍照記錄，并用Wood燈分析色素恢復的狀況，記錄復色情況及不良反應。

圖1 培養(yǎng)的皮膚表皮片生長情況 1A：培養(yǎng)成功準備移植的表皮片；1B：多巴染色，可見復層表皮片中的黑素細胞（×400）；1C：培養(yǎng)表皮縱切面，顯示復層表皮片，厚度為100μm（HE×200）

結(jié) 果

一、患者資料及有效率

15例患者年齡18～62歲，平均28.6歲。病程1.5～49年，平均病程12.1年，穩(wěn)定時間1～20年，平均穩(wěn)定時間5.55年?；颊咧泄?jié)段型9例，散發(fā)型3例，局限型3例。手術(shù)部位在面頸部7例，頸部4例，胸前2例，上臂部2例，雙下肢1例，其中1例頸部和上臂部同時手術(shù)治療。術(shù)后第12個月隨訪，復色率評估發(fā)現(xiàn)，9例節(jié)段型白癜風患者中6例達到100%復色（圖2、3），3例復色面積75%～100%。3例散發(fā)型患者手術(shù)效果欠佳，其中1例男性患者術(shù)后1個月隨訪，未見明顯復色，后失訪；另2例患者術(shù)后第12個月隨訪，復色面積分別為50%～75%和＜50%。3例局限型患者中2例復色面積＞75%，1例＜50%。術(shù)后第1、3、6、12個月隨訪，應用Wood燈檢測色素恢復情況，與術(shù)前比較可以看到明顯的黑素生成，而皮損處則脫失（圖3）。

二、培養(yǎng)表皮膜片的擴增倍數(shù)及黑素細胞含量

復層表皮片培養(yǎng)平均時間28.67 d，擴增倍數(shù)最小14倍，最大擴增到68.8倍，平均擴增35.77倍。本實驗中黑素細胞與角質(zhì)形成細胞的比例在1∶20到1∶30之間。

三、患者隨訪情況及不良反應

隨訪患者時間最長24個月，色素恢復情況良好。隨著隨訪時間的延長，可以看到部分患者復色面積逐漸擴大，皮膚顏色更加均勻?；颊呤中g(shù)部位無自發(fā)性脫色及皮疹復發(fā)，無感染、水皰等嚴重不良反應。1例女性患者胸前鎖骨處皮損磨削移植后出現(xiàn)一處長約2 cm的瘢痕，高出皮面，色紅，術(shù)后3個月最明顯，給予外用糖皮質(zhì)激素軟膏，并局部皮損內(nèi)注射復方倍他米松注射液，每月1次，共2次，1年后隨訪，瘢痕逐漸變平，18個月時明顯變平，呈膚色。供皮區(qū)最嚴重的不良反應為殘留瘢痕，由于取皮部位隱蔽，患者均可以接受。

圖3 1例左手臂節(jié)段型白癜風患者術(shù)前及術(shù)后隨訪 3A：左手臂皮損治療前；3B：術(shù)后18個月隨訪，皮膚顏色復色良好

討 論

組織工程皮膚的研究最早始于表皮細胞的成功培養(yǎng)。1975年Rheinwald和Green采用3T3細胞作為滋養(yǎng)層，在體外成功連續(xù)培養(yǎng)人表皮角質(zhì)形成細胞［6］。1981年 O′Connor等首次將此種方法培養(yǎng)的自體表皮膜片（cultured epithelial autograft，CEA）用于燒傷創(chuàng)面的修復，獲得成功［7］。成功的皮膚移植可以使燒傷后的色素減退復色，說明黑素細胞可以移植到色素脫失皮膚處。1997年，Kumagai和Uchikoshi［5］報道了應用Green方法培養(yǎng)自體表皮膜片，成功治療了6例不同類型的色素減退患者（白癜風、斑駁病和白化?。Ｄ壳?，已有多種皮膚產(chǎn)品問世，并用于臨床治療且取得了一定療效。按照結(jié)構(gòu)的不同，構(gòu)建的人工皮膚可分為表皮替代物、真皮替代物、復合皮替代物三種類型，本文采用的表皮膜片屬于表皮替代物。之前的組織工程皮膚只關(guān)注角質(zhì)形成細胞，而在皮膚科領域尤其是針對脫色素疾病的治療，則更關(guān)注黑素細胞與角質(zhì)形成細胞之間的關(guān)系，使培養(yǎng)的表皮更接近正常，達到美容的效果。

應用培養(yǎng)的表皮片治療比單純培養(yǎng)黑素細胞治療白癜風具有很多優(yōu)勢［8-10］：首先角質(zhì)形成細胞可以調(diào)節(jié)黑素細胞的生長和分化；與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)可以使黑素細胞保持其生理學特性；培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞比單純培養(yǎng)黑素細胞更容易在短時間內(nèi)獲得較大的自體培養(yǎng)皮片；在應用此方法的20余年間尚未報告出現(xiàn)腫瘤風險升高。Guerra等［11］應用培養(yǎng)的自體表皮片移植，成功治療了32例穩(wěn)定期白癜風患者。除了肢端和腔口部位療效略差，其他部位的皮損可以達到88%～96%的復色。我們也是采用自體培養(yǎng)含有黑素細胞的復層表皮膜片的方法移植治療穩(wěn)定期白癜風患者，15例患者中6例節(jié)段型白癜風患者達到100%復色，6例達到75%～100%復色。與傳統(tǒng)的表皮吸皰移植、單純磨削治療比較，可以1次治療較大的面積，而供皮區(qū)只需要小塊皮膚。該方法顏色恢復均勻，較少出現(xiàn)鵝卵石樣外觀，患者的滿意度較高。腔口部位的皮損，如口周，由于固定難度較大，色素恢復情況欠佳，在手術(shù)和包扎過程中需要引起重視。

在治療效果方面，節(jié)段型和局限型白癜風患者療效較好，優(yōu)于其他患者，這與 Matsuzaki和 Kumagai［12］2013年的研究結(jié)果相似。本研究中6例節(jié)段型患者達到100%復色，3例局限型患者中2例也都達到75%～100%復色。與其他外科治療方法一致，節(jié)段型和局限型穩(wěn)定期白癜風患者，在其他治療方法無效的情況下，可應用自體培養(yǎng)表皮片移植。本研究最長隨訪24個月，未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應，無自發(fā)性褪色出現(xiàn)。遠期效果還在進一步觀察中。

培養(yǎng)表皮片移植治療白癜風對培養(yǎng)有較高的要求。好的臨床療效取決于培養(yǎng)表皮中黑素細胞含量的多少。因此在臨床應用時需要將培養(yǎng)組織中黑素細胞的含量作為質(zhì)量控制的主要指標。多巴染色是比較簡單易行的方法，染色計數(shù)后可以估算黑素細胞和角質(zhì)形成細胞的比例。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)表皮片中黑素細胞與角質(zhì)形成細胞的比例在1∶20～1∶30比較理想，而且容易做到，臨床上易收到良好的療效。

體外培養(yǎng)自體表皮片移植治療白癜風是一種較好的治療方法，但也有其局限性，比如培養(yǎng)成本和人工費用均高出常規(guī)手術(shù)方法；對培養(yǎng)技術(shù)的要求較高，尤其臨床應用時，要求培養(yǎng)皮片穩(wěn)定，養(yǎng)成率高且要保證一定的擴增面積；培養(yǎng)周期較長，一般需2～4周時間。在前期的研究中，我們使用3T3細胞作為支架，雖然隨著皮片的生長滋養(yǎng)細胞逐漸退化，但在大批臨床應用中仍需慎重。2013年后我們開始研發(fā)和應用無滋養(yǎng)層的表皮膜片培養(yǎng)方法，并在臨床應用。目前隨訪的患者中發(fā)現(xiàn)其對臨床療效無明顯影響，且更安全，更適于大規(guī)模的開展應用。但目前的研究仍需更多的臨床病例以及更長的隨訪時間，積累更多資料。

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［4］江蕾薇,陸洪光,蔡靈龍.角質(zhì)形成細胞與黑素細胞體外構(gòu)建含黑素的組織工程皮膚［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（2）:110-113.

［5］Kumagai N,Uchikoshi T.Treatment of extensive hypomelanosis with autologous cultured epithelium ［J］.Ann Plast Surg,1997,39（1）:68-73.

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［11］Guerra L,Capurro S,Melchi F,et al.Treatment of"stable"vitiligo by Timedsurgery and transplantation ofcultured epidermal autografts［J］.Arch Dermatol,2000,136（11）:1380-1389.

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2014-05-08）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

Transplantation of tissue-engineered epithelial autografts bearing melanocytes for the treatment of vitiligo:a preliminary clinical study

Li Jian*,Wu Wenyu,Chen Shujun,Fu Wenwen,Xu Jinhua,Taro Uyama,Xu Yu,Xiang Leihong.*Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

Xu Jinhua,Email:xjhhsyy@163.com

ObjectiveTo evaluate the clinical efficacy and safety of transplantation of cultured epithelial autografts bearing melanocytes for the treatment of stable vitiligo.MethodsFifteen patients aged 18-65 years with stable vitiligo were enrolled into this study from February to December in 2012.Normal skin tissues measuring 3－7.5 cm2in size were harvested from these patients.According to the method described by Green,epidermal cells from these tissues were cultivatedin vitro.After about 3 weeks of culture,keratinocytes formed epidermal grafts with some tension,which were subjected to autologous transplantation followed by compression bandaging.The sutures were removed after 2 weeks.Follow-up was carried out after transplantation.Repigmentation was analyzed by Wood′s lamp,and adverse reactions were recorded.ResultsDuring the 12－24 months of follow-up,1 patient was lost to follow up.Among the 15 patients with vitiligo,6 with segmental vitiligo achieved 100%repigmentation,and another 6 achieved 75%－100%repigmentation.Lesions on the face and neck showed better repigmentation than those on the trunk after the transplantation.Conclusion Transplantation of cultured tissue-engineered epithelial autografts bearing melanocytes is effective and safe for the treatment of stable vitiligo,and worthy of clinical application.

Vitiligo;Melanocytes;Tissue engineering;Transplantation,autologous;Organ culture techniques;Reconstructive surgical procedures;Skin transplantation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.005

上海市科委引導類課題（124119a1002）；上海市“重中之重”重點學科項目；衛(wèi)生部重點臨床專科項目

200040上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科（李劍、吳文育、陳淑君、傅雯雯、徐金華、徐昱、項蕾紅）；日本國立成育醫(yī)療中心（Taro Uyama）

徐金華，Email：xjhhsyy@163.com