郭湘云，李 華，鄭風(fēng)榮，王 波，徐宗軍，丁倩倩，趙 盟，李 青

（1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連116023；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266000）

神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NPY）是由瑞典科學(xué)家Tatenoto K［1］于1982年首次從豬腦組織中得到的一種單鏈多肽，在結(jié)構(gòu)上，與酪酪肽（Peptide Tyrosine Tyrosine，PYY）和胰多肽（Polypeptide，PP）十分相似，故認(rèn)為同屬胰多肽家族［2－3］。NPY基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，成熟活性肽由36個(gè)氨基酸組成，迄今為止，所研究的脊椎動(dòng)物發(fā)現(xiàn)都含有NPY基因，并且物種之間的NPY保持高度同源性［4－5］。在魚類的食欲調(diào)控因子中，NPY被認(rèn)為是調(diào)控?cái)z食最為關(guān)鍵的因子，而且NPY已經(jīng)被證實(shí)對(duì)攝食有明顯的促進(jìn)作用，如金魚、草魚等［6－9］。但關(guān)于NPY與星斑川鰈攝食的研究還未見報(bào)道。

星斑川鰈（Platichthysstellatus）隸屬硬骨魚綱（Osleichthyes），鰈形目（Pleuronectiformes），鰈科（Pleuronectidae），川鰈屬（Platichthys），分布于我國(guó)黃海中北部海區(qū)沿岸，星斑川鰈繁殖力強(qiáng)，性情溫馴，適宜于進(jìn)行集約化養(yǎng)殖，是重要的新型海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。目前關(guān)于調(diào)節(jié)星斑川鰈攝食的研究多數(shù)是調(diào)整飼養(yǎng)結(jié)構(gòu)及養(yǎng)殖環(huán)境等方面因素，很少有從分子水平上研究星斑川鰈食欲與調(diào)控機(jī)理及其影響因子，從而揭示其攝食調(diào)控和能量代謝關(guān)系的研究。本實(shí)驗(yàn)以星斑川鰈為材料，克隆了星斑川鰈神經(jīng)肽NPY基因cDNA序列，并利用Real－time PCR檢測(cè)了NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的分布情況，并研究了饑餓對(duì)NPY在腦組織表達(dá)的影響，從而為進(jìn)一步研究NPY在促進(jìn)星斑川鰈攝食方面的分子機(jī)制而建立一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

星斑川鰈取自日照海洋水產(chǎn)資源增殖站，健康養(yǎng)殖魚共60尾，采樣時(shí)間為2013－10，體表完好，長(zhǎng)約15 cm，重約200g。解剖取魚的腦組織立即存放于液氮中，備用。

1.2 RNA提取

取正常健康的星斑川鰈的腦組織，采用TRIZOL Reagent（康為世紀(jì)）提取總RNA，使用RNase Free DNaseⅠ（TaKaRa）對(duì)總RNA進(jìn)行處理以除去DNA污染，最終定容于無RNase水。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260／OD280比值以檢測(cè)RNA純度并計(jì)算濃度，同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。純化后的總RNA溶液保存于－80℃。

1.3 NPY cDNA的5′RACE和3′RACE

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的星斑川鰈腦組織的轉(zhuǎn)錄組庫中的NPY部分序列，利用Primers 5.0設(shè)計(jì)引物GSP2、GSP1（表1），以通用引物UPM（universal primer）作為上、下游引物擴(kuò)增目的片段，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒（Clontech）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、5′RACE擴(kuò)增和3′RACE擴(kuò)增。3′RACE程序?yàn)椋?5℃4min；95℃45s，63℃45s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。5′RACE程序?yàn)?5℃4min；95℃45s，65℃45s；72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（生工生物工程有限公司）切膠回收5′RACE產(chǎn)物及3′RACE產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化后連接到PTZ57R／T（Thermo）載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.ColiDH5α中，涂平板、挑菌，經(jīng)PCR檢測(cè)陽性克隆后進(jìn)行擴(kuò)培，采用試劑盒提取質(zhì)粒DNA（生工生物工程（上海）有限公司），送上海桑尼公司進(jìn)行測(cè)定序列，將5′RACE和3′RACE獲得的基因片段連接為NPY cDNA全長(zhǎng)，用引物NPY－F和NPY－R進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證，并與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 實(shí)驗(yàn)使用引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.4 生物信息學(xué)分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)；利用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接；用GENSCAN軟件確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；用ProtParam預(yù)測(cè)理化性質(zhì)；用PredictProtein預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)；用獲得的星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種神經(jīng)肽Y氨基酸序列進(jìn)行Clustal W比對(duì)，然后用 MEGA 5.0軟件 Neighbor－joining法（bootstrap values為1 000）進(jìn)行分子進(jìn)化分析；利用SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用I－TASSER軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.5 星斑川鰈NPY基因的組織表達(dá)及饑餓對(duì)其表達(dá)影響

采用Realtime PCR法檢測(cè)NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的相對(duì)表達(dá)量和在不同饑餓程度時(shí)腦組織中的表達(dá)水平變化。

取自日照市海洋水產(chǎn)資源增殖站的健康星斑川鰈50尾，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)5d，試驗(yàn)期間海水溫度保持在18℃左右，每天換水，充氧。共設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組，每處理組3組重復(fù)，每組重復(fù)5尾星斑川鰈，分別在0，24，72h饑餓時(shí)間在3組試驗(yàn)魚中取樣，每組隨機(jī)抽取5尾魚取其腦組織，使用Prime ScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

根據(jù)得到的星斑川鰈NPY cDNA全序列，設(shè)計(jì)特異性引物Q－NPY F和Q－NPY R，以β－actin作為內(nèi)參引物（表1）。以各組織RNA和不同饑餓時(shí)間的腦組織RNA為模板，采用Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche）進(jìn)行Real－time PCR程序采用2步法，其中退火和延伸歸結(jié)為一步：95℃10 min；95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)。

內(nèi)參基因在各個(gè)組織中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)基因的表達(dá)水平變化時(shí)作為參照物，目的基因的CT值與內(nèi)參基因的CT值之間的差稱為ΔCT，處理組ΔCT與未處理組ΔCT之間的差為－ΔΔCT，2－ΔΔCT值即為樣品的該基因的相對(duì)表達(dá)水平，校準(zhǔn)樣品恒定為1。利用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），設(shè)定差異顯著水平P為0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)即差異顯著，當(dāng)P＜0.01時(shí)即差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 星斑川鰈NPY基因cDNA序列序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.1 星斑川鰈NPY基因cDNA序列序列分析

星斑川鰈NPY基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列（圖1）。利用在線工具GENSCAN（http：∥genes.mit.edu／GENSCAN.html）分析得知：該cDNA全長(zhǎng)559bp，5′UTP含有13個(gè)堿基，3′UTP含有235個(gè)堿基，開放閱讀框?yàn)?10bp，編碼69個(gè)氨基酸。

2.1.2 星斑川鰈NPY預(yù)測(cè)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線工具ProtParam（http：∥web.expasy.org）分析編碼的氨基酸，結(jié)果顯示其理論分子量為7.98 kDa，分子式為C355H559N95O112S1，總共有1 122個(gè)原子組成，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)（theoretical pI）為5.24，理論推測(cè)半衰期（estimated half－life）在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中為30h，不穩(wěn)定系數(shù)為85.57，可推斷為不穩(wěn)定蛋白，總帶正電殘基（Arg＋Lys）為9，總帶負(fù)電殘基（Asp＋Glu）為11，總平均親水性（grand average of hydropathicity）為－0.800，脂肪系數(shù)（aliphatic index）為83.48。

表2 星斑川鰈NPY氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of NPY in Platichthys stellatus

圖1 星斑川鰈NPY cDNA核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of Neuropeptide Y fromPlatichthys stellatus

2.1.3 星斑川鰈NPY預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，在NPY蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α－螺旋（Alpha helix）占47.83%，β－轉(zhuǎn)角（Beta turn）占2.90%，無規(guī)則卷曲（Random coil）占49.28%（圖2）。

圖2 SOPMA軟件對(duì)NPY蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.2 Secondary structure of Platichthys stellatus NPY protein analyzed by SOPMA

2.1.4 星斑川鰈NPY預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過I－TASSER軟件預(yù)測(cè)了星斑川鰈NPY蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 I－TASSER軟件對(duì)NPY蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.3 Tertiary structure of Platichthys stellatus NPYprotein analyzed by I－TASSER

2.2 星斑川鰈NPY氨基酸的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 星斑川鰈NPY氨基酸的同源性分析

將星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種的NPY氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明：星斑川鰈NPY與美國(guó)黃蓋鰈（Pseudopleuronectesamericanus）的同源性最高，為100%；與鱸形目花鱸（Lateolabrax japonicus）、鰤?mèng)~（Seriolaquinqueradiata）、點(diǎn)帶石斑 魚（Epinepheluscoioides）、軍 曹 魚（Rachycentron canadum）、黑鯛（Acanthopagrusschlegeli）的同源性分別為99%，97%，97%，97%，97%（圖4）。

圖4 星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種NPY氨基酸序列的比較Fig.4 Amino acid sequence aligenment of NPY fromPlatichthys stellatus with other fishes

2.2.2 星斑川鰈NPY系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過MEGA5.0軟件構(gòu)建了星斑川鰈NPY cDNA和氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：星斑川鰈NPY與鰈形目魚類的親緣關(guān)系較近，與美洲擬鰈聚為一支，這與上述Blast的分析結(jié)果一致（圖5，圖6）。

圖5 星斑川鰈NPY cDNA序列與其他脊椎動(dòng)物的NPY系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the cDNA sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

圖6 星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的NPY系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

2.3 星斑川鰈NPY mRNA的組織分布分析

采用Real time PCR法，以β－actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的表達(dá)分布。結(jié)果表明：NPY mRNA在腦、心臟、性腺、肝、腸、腎組織都有表達(dá)，但在表達(dá)量上有明顯差異，心臟和腎組織相對(duì)表達(dá)量較少。統(tǒng)計(jì)分析表明：NPY mRNA在腦、性腺組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05）；而在肝和腸組織之間的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）（圖7）。

圖7 星斑川鰈NPY mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of NPY mRNA in various tissues of Platichthys stellatus

2.4 饑餓對(duì)星斑川鰈NPY mRNA表達(dá)水平分析

利用Real－time PCR法檢測(cè)了星斑川鰈NPY在不同饑餓程度時(shí)腦組織中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明：NPY在腦組織中的表達(dá)隨著饑餓程度的增加而增加，饑餓72h的NPY mRNA相對(duì)表達(dá)量高于饑餓24h的相對(duì)表達(dá)量，但差異不顯著（P＞0.05）（圖8）。

圖8 饑餓對(duì)NPY mRNA在腦組織中表達(dá)的影響Fig.8 Relative expression level of NPY mRNA in brain tissues of Platichthys stellatus

3 討論

本文通過SMART－RACE技術(shù)在星斑川鰈腦組織中擴(kuò)增出NPY cDNA序列，其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α－螺旋和無規(guī)則卷曲含量相對(duì)比較高。α－螺旋構(gòu)象是相當(dāng)穩(wěn)定的、最普遍的螺旋形式，無規(guī)則卷曲往往與生物活性相關(guān)，對(duì)外界的理化因子極為敏感。這表明NPY結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有較高的生物活性。

同源性分析比較結(jié)果顯示，不同物種間NPY存在高度一致性，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也同樣地表明了，星斑川鰈NPY與鰈形目魚類的親緣關(guān)系較近，與美洲擬鰈聚為一支，這說明了在物種的進(jìn)化過程中，NPY基因中對(duì)于發(fā)揮自身功能必須的特定結(jié)構(gòu)，即使經(jīng)過自然選擇，這些結(jié)構(gòu)依舊被保留了下來，而存在些許的差異，可以認(rèn)為是適應(yīng)性選擇的必然結(jié)果。

采用Realtime PCR方法檢測(cè)了NPY在各組織中的分布情況。結(jié)果表明NPY mRNA在腦、心臟、性腺、肝、腸、腎組織均有表達(dá)，而且主要在腦組織中表達(dá)，該特征與其他硬骨魚類相同［10－11］。NPY分布在不同的組織可能對(duì)應(yīng)著不同的生理功能，下丘腦是動(dòng)物攝食的調(diào)控中心，表達(dá)的NPY可以促進(jìn)動(dòng)物攝食；NPY分布在星斑川鰈腸道里，可能參與腸道蠕動(dòng)和消化吸收的調(diào)節(jié)；分布在心臟，可能與調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)提取不同饑餓處理組的星斑川鰈腦組織RNA，應(yīng)用Realtime－PCR對(duì)NPY mRNA表達(dá)量變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：饑餓導(dǎo)致腦組織中的 NPY mRNA表達(dá)量升高，這與Lopez－Patino［12］和Silverstein［13－14］的研究結(jié)果一致。在對(duì)其他魚類的研究中也得出：食物缺乏會(huì)使下丘腦中NPY mRNA的表達(dá)量升高，例如斑點(diǎn)叉尾（Ictaluruspunctatus）、冬鰩（Rajaocellata）、巴南牙鲆（Paralichthysorbignyanus）等［15－17］；將NPY重組蛋白通過腹腔注射到羅非魚（Oreochromissp.）中，可以促進(jìn)其攝入食物量及其魚體質(zhì)量的增加［18］。金魚饑餓24～72h使下丘腦的NPY mRNA含量呈現(xiàn)時(shí)間依存的增加；降低金魚的食量至正常水平50%，亦使下丘腦的NPY mRNA明顯增加［19］。

NPY的促進(jìn)食欲作用與NPY受體有關(guān)。研究表明，NPY的Y1和Y5受體參與NPY對(duì)食欲的促進(jìn)作用［20－22］。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明：NPY生物合成的最初部位主要在下丘腦弓狀核（ARC），少部分分布于室旁核（PVN）、背中核（DMN）等區(qū)域，弓狀核NPY神經(jīng)元的軸突投射到室旁核，經(jīng)室旁核分泌NPY與特定的受體Y1或Y5結(jié)合，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)攝食過程。研究顯示，在饑餓、劇烈運(yùn)動(dòng)、體重降低、泌乳等能量嚴(yán)重消耗情況下，下丘腦中的ARC－PVN路徑可被激活，進(jìn)而增加食欲和攝食量［23－25］。

動(dòng)物攝食一直是人們研究的重點(diǎn)內(nèi)容，NPY作為魚類攝食調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性因子，研究其調(diào)節(jié)機(jī)理具有重要意義，本研究克隆了星斑川鰈的NPY cDNA序列，預(yù)測(cè)了其蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，為在mRNA水平研究NPY生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)，為進(jìn)一步在蛋白水平上研究星斑川鰈的繁殖發(fā)育和遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

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