賈艷麗，王江勇，孫敬鋒

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院 南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州510300；2.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510300；3.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)系，天津300384）

鮑（Abalone）的分類地位屬于軟體動(dòng)物門、腹足綱、前鰓亞綱、原始腹足目、鮑科、鮑屬［1］，賦有“海產(chǎn)八珍”之一的美譽(yù)，鮑自古便是餐桌上的上等菜肴，除去可食用部位，其外殼亦可入藥，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥學(xué)價(jià)值。在中國(guó)，鮑的養(yǎng)殖主要分布在大連、山東、福建、廣東、海南、廣西等沿海地區(qū)，主要養(yǎng)殖種類為北方沿海的皺紋盤鮑（HaliotisdicushannaiIno）以及南方沿海的雜色鮑（HaliotisdiversicolorReeve）［2］，2011年的產(chǎn)量居世界第一，中國(guó)已成為世界第一養(yǎng)鮑大國(guó)［3－4］。

然而由于大規(guī)模生產(chǎn)導(dǎo)致的環(huán)境惡化、近交嚴(yán)重、種質(zhì)退化以及病害頻發(fā)［5－9］等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了鮑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。作為鮑的主產(chǎn)區(qū)，南方海域雜色鮑不明原因的大規(guī)模死亡給鮑產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［10－11］，科研工作者嘗試將北方的皺紋盤鮑引進(jìn)南方養(yǎng)殖，在一定程度上緩解了這種壓力，然而皺紋盤鮑高溫季節(jié)的死亡率不容忽略，因此進(jìn)一步提高皺紋盤鮑的耐高溫性能是科研工作者的研究方向。賈艷麗等①賈艷麗，王江勇，劉廣鋒，等.高溫脅迫對(duì)皺紋潘鮑幼鮑生長(zhǎng)和存活的影響.南方水產(chǎn)科學(xué)，2014接收已經(jīng)篩選出具有一定抗逆性能的皺紋盤鮑雜交鮑，通過(guò)高溫脅迫試驗(yàn)得出該鮑耐受溫度可超過(guò)30℃，該試驗(yàn)從生理學(xué)角度探索其耐高溫性能，期望能夠?yàn)榕嘤隹鼓嫘詮?qiáng)的新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)時(shí)間為2013年11月中旬至2013年12月末，選取生長(zhǎng)健康殼長(zhǎng)接近10mm的皺紋盤鮑360只，平均放置于15個(gè)尺寸為50cm×30cm×40cm的玻璃水缸中，玻璃缸內(nèi)放置鮑磚以供鮑附著并有一定的遮光作用。試驗(yàn)共分4組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行30只鮑，試驗(yàn)開始時(shí)選取殼長(zhǎng)相近的幼鮑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)測(cè)量并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后可知各組鮑的平均殼長(zhǎng)為11±0.50mm，平均殼寬8±0.50mm，濕質(zhì)量為0.2±0.05g，均值、標(biāo)準(zhǔn)差和組間的差異性詳見表1。

表1 各組鮑試驗(yàn)開始時(shí)的規(guī)格Table 1 Size of each group at the beginning of the research

1.2 日常管理

每個(gè)水缸接通一個(gè)充氣石保證溶氧不低于5mg·L－1。試驗(yàn)期間每天下午投喂適量鮑配合飼料，次日早晨采用虹吸法從底部清除殘餌和糞便，并添加經(jīng)過(guò)濾及預(yù)熱至所需溫度的新鮮海水，依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)記錄死亡情況，通過(guò)控制加熱棒的溫度來(lái)調(diào)節(jié)試驗(yàn)組溫度，溫差范圍控制在±0.5℃以內(nèi)。

1.3 試驗(yàn)方法

將上述15個(gè)玻璃水缸平均分為4組，每組3個(gè)平行，其中一組為對(duì)照組，水溫維持自然水溫（實(shí)驗(yàn)開始時(shí)溫度為22℃，在20～23℃變化），其他4組利用加熱棒（JEBO佳寶）采用溫度漸變（30℃以下每3d升溫1℃，30℃以上每周升溫1℃）的方式分別升溫至25，28和31℃。當(dāng)溫度升至預(yù)定溫度并維持一周后采樣，每個(gè)平行取3只鮑，－80℃保存，由于鮑個(gè)體小，不能取出足夠血淋巴進(jìn)行免疫因子的測(cè)定，該試驗(yàn)所取樣本為鮑的肌肉組織。免疫因子（堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM））和組織中總蛋白含量（BCA）的具體測(cè)定方法見南京建成生物工程研究所研制的試劑盒使用說(shuō)明，每個(gè)平行取3只鮑，分別測(cè)定每只鮑上述幾種免疫因子的活性。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行溫度控制時(shí)，用加熱棒對(duì)水體進(jìn)行加熱，其他環(huán)境條件一致，在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)可以忽略其他因素的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照所購(gòu)買試劑盒說(shuō)明書的公式計(jì)算各種酶的活性，并繪制溫度－酶活性柱形圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫對(duì)皺紋盤鮑幼鮑SOD活性的影響

水溫由22℃升到25℃時(shí)，皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)SOD活性升高3倍，差異顯著（P＜0.05，圖1）；當(dāng)水溫升至28℃時(shí)，SOD活性在25℃的基礎(chǔ)上升高近2倍，同樣有顯著差異（P＜0.05，圖1）；然而，當(dāng)溫度由28℃升至31℃時(shí)，SOD的活性變化不顯著（P＞0.05，圖1）。

圖1 各試驗(yàn)組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)SOD活性Fig.1 SOD activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.2 高溫脅迫對(duì)皺紋盤鮑幼鮑AKP活性的影響

水溫由22℃升至25℃時(shí)，AKP的活性升高（P＞0.05，圖2）；水溫由25℃升至28℃時(shí)，AKP活性顯著升高（P＜0.05，圖2）；水溫由28℃升至31℃時(shí)，AKP活性不再上升，出現(xiàn)下降的趨勢(shì)（P＞0.05，圖2）。

圖2 各試驗(yàn)組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)AKP活性Fig.2 AKP activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.3 高溫脅迫對(duì)皺紋盤鮑幼鮑ACP活性的影響

水溫由22℃升至25℃時(shí)，ACP的活性上升（P＞0.05，圖3）；水溫由25℃升至28℃時(shí)，ACP活性顯著升高（P＜0.05，圖3）；水溫由28℃升至31℃時(shí)，ACP活性顯著升高（P＜0.05，圖3）。

圖3 各試驗(yàn)組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)ACP活性Fig.3 ACP activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.4 高溫脅迫對(duì)皺紋盤鮑幼鮑LZM活性的影響

水溫由22℃升至25℃時(shí)，LZM的活性升高（P＞0.05，圖4）；水溫由25℃升至28℃時(shí)，LZM活性顯著升高（P＜0.05，圖4）；水溫由28℃升至31℃時(shí)，LZM活性出現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05，圖4）。

圖4 各試驗(yàn)組皺紋盤鮑幼鮑體內(nèi)LZM活性Fig.4 LZM activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

3 討論

非特異性免疫是生物與生俱來(lái)的保護(hù)屏障，對(duì)外界刺激有直接并迅速的反應(yīng)，因此非特異性免疫因子的變化情況能夠反映出生物體在外界刺激下的機(jī)體狀況，下面分別闡述在高溫脅迫下鮑幾種非特異性免疫因子的變化情況。

3.1 高溫脅迫對(duì)鮑肌肉組織中SOD活性的影響

SOD是參與防御抗氧化的關(guān)鍵酶之一，當(dāng)生物機(jī)體受到外界刺激時(shí)會(huì)不同程度的影響SOD的活性，短期輕度的逆境脅迫會(huì)使SOD活性升高來(lái)消除這種脅迫造成的損傷，長(zhǎng)期重度逆境脅迫往往會(huì)使SOD活性降低從而使機(jī)體受到傷害［12］。溫度升高會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，此時(shí)就需要SOD來(lái)催化過(guò)氧陽(yáng)離子的歧化反應(yīng)，消除自由基造成的傷害［13－15］。該試驗(yàn)采用溫度漸變的方式對(duì)皺紋盤鮑幼鮑進(jìn)行溫度脅迫，當(dāng)溫度由22℃升高至28℃時(shí)SOD的活性顯著升高，這與上述理論相符，而當(dāng)溫度由28℃升高至31℃時(shí)，SOD活性沒(méi)有顯著變化，這可能是因?yàn)镾OD活性已經(jīng)升高到機(jī)體所能調(diào)控的最高值，如果溫度繼續(xù)升高可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，就該實(shí)驗(yàn)而言，皺紋盤鮑幼鮑對(duì)31℃這一溫度存在耐受性。溫度驟變條件下三疣梭子蟹［15］SOD活性變化以及溫度驟變對(duì)南美白對(duì)蝦［16］抗氧化系統(tǒng)的影響與該溫度漸變條件下皺紋盤鮑幼鮑SOD活性變化有異曲同工的效果，時(shí)少坤［17］研究的水溫脅迫對(duì)雜交鮑免疫因子的影響中，6，12，24℃組SOD活性與對(duì)照組18℃組無(wú)顯著差異，30℃組SOD活性顯著降低，而該實(shí)驗(yàn)中31℃組SOD的活性仍處于較高水平，根據(jù)兩種鮑在高溫下SOD活性大小的差異可以推測(cè)該實(shí)驗(yàn)所選皺紋盤鮑幼鮑比時(shí)少坤的研究中所選雜交鮑能夠耐受更高的溫度。

3.2 高溫脅迫對(duì)鮑肌肉組織中磷酸酶AKP、ACP活性的影響

磷酸酶是生物機(jī)體重要的代謝調(diào)控酶類，參與磷酸基團(tuán)的代謝和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也是溶酶體的重要組成部分，當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)物質(zhì)入侵時(shí)，能夠及時(shí)參與物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)破壞或消除外來(lái)物質(zhì)的侵害，達(dá)到防御的作用［18－19］。隨著溫度由22℃升高到28℃，AKP和ACP活性均通過(guò)不同程度的升高來(lái)調(diào)控機(jī)體適應(yīng)這種外界條件的改變。在31℃條件下，ACP活性繼續(xù)升高而AKP活性沒(méi)有繼續(xù)升高，這可能是機(jī)體對(duì)兩種酶的調(diào)控存在一定的差異，也可推測(cè)31℃下的ACP或AKP活性已達(dá)到或接近機(jī)體承受的上限，溫度再高的話會(huì)引起機(jī)體損傷。這與時(shí)少坤［17］研究的溫度漸變下ACP活性無(wú)顯著變化，但30℃下活性顯著下降結(jié)果類似，也可支持該實(shí)驗(yàn)的推測(cè)。同理，溫度驟變會(huì)引起ACP、AKP活性顯著變化這一現(xiàn)象也在吳丹華等［15］、李強(qiáng)等［19］對(duì)三疣梭子蟹免疫因子的影響研究中得到證實(shí)。

3.3 高溫脅迫對(duì)鮑肌肉組織中LZM活性的影響

溶菌酶是一種水解酶，可以減輕機(jī)體內(nèi)毒素帶來(lái)的傷害，可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，在非特異性免疫中也發(fā)揮重要作用，其活性大小受到溫度、pH和化學(xué)物質(zhì)等的影響［20］。溫度對(duì)水生動(dòng)物的影響至關(guān)重要，機(jī)體溶菌酶活力的大小直接反映了水生動(dòng)物的免疫狀況，因此機(jī)體LZM活力的大小是衡量該溫度是否適宜生物生存的重要指標(biāo)［21］。該實(shí)驗(yàn)中隨著溫度由22℃升高到28℃，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)LZM活性的升高提高了免疫狀況來(lái)度過(guò)這種外界脅迫，時(shí)少坤［17］的研究中高溫下（30℃）皺紋盤鮑LZM活性顯著下降，同樣也有研究證實(shí)水溫升高會(huì)使黑唇鮑［22］、近江牡蠣［23］、櫛孔扇貝［24］、菲律賓蛤仔［25］LZM 活性下降，在31 ℃ 條件下LZM活性相對(duì)于28℃有顯著下降的趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組22℃下的活性，說(shuō)明該種幼鮑可以耐受31℃的高溫，但活性有所下降說(shuō)明機(jī)體在過(guò)高溫度下會(huì)出現(xiàn)免疫下降的狀況。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)幾種非特異性免疫因子的變化情況對(duì)所選皺紋盤鮑幼鮑的耐溫性進(jìn)行了初步分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)行下一步的篩選工作提供了很好的基礎(chǔ)，項(xiàng)目組將對(duì)28℃以上高溫中仍然存活下來(lái)的皺紋盤鮑幼鮑繼續(xù)進(jìn)行選育，選出更具耐高溫潛力的品系，并進(jìn)一步研究鮑體內(nèi)非特異性免疫因子在受外界刺激后的變化和對(duì)機(jī)體的保護(hù)機(jī)制，然而熱休克轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已經(jīng)在線蟲中展開了研究［26］，在后續(xù)的試驗(yàn)中將選取不同地區(qū)選育的皺紋盤鮑幼鮑進(jìn)行對(duì)比，結(jié)合其在高溫條件下的生長(zhǎng)、死亡情況、體內(nèi)的生理生化反應(yīng)［27］和溫度驟變條件下熱休克蛋白的表達(dá)情況對(duì)比分析不同來(lái)源鮑對(duì)高溫的耐受性，試圖探尋其耐熱機(jī)理，為抗逆雜交鮑的選育提供依據(jù)。

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