方春鳳 吳 洋 李兆福 劉 濤 劉維超 狄朋桃*

（1云南省中醫(yī)醫(yī)院兒科，昆明650021；2云南省中醫(yī)醫(yī)院風濕科，昆明650021；3云南中醫(yī)學(xué)院科技處，昆明650500；4云南省中醫(yī)醫(yī)院病理科，昆明650021）

蠲痹顆粒對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響※

方春鳳1吳 洋2李兆福3劉 濤4劉維超2狄朋桃2*

（1云南省中醫(yī)醫(yī)院兒科，昆明650021；2云南省中醫(yī)醫(yī)院風濕科，昆明650021；3云南中醫(yī)學(xué)院科技處，昆明650500；4云南省中醫(yī)醫(yī)院病理科，昆明650021）

目的探討蠲痹顆粒對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨軟骨細胞凋亡的影響，揭示其治療骨關(guān)節(jié)炎（OA）的部分作用機制，為蠲痹顆粒方治療OA提供理論依據(jù)。方法將42只新西蘭兔采用改良Hulth法建立兔膝OA模型，造模后，隨機分為假手術(shù)組、模型組、蠲痹顆粒組及陽性藥（雙醋瑞因）組。藥物干預(yù)或灌生理鹽水6周后，取出關(guān)節(jié)軟骨，石蠟切片HE染色觀察軟骨組織鏡下病理形態(tài)改變，免疫組化法檢測軟骨組織caspase-3表達水平，TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡情況。結(jié)果蠲痹顆粒組和陽性藥對照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織caspase-3蛋白的表達、軟骨細胞凋亡率明顯低于模型組，比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論蠲痹顆粒能下調(diào)caspase-3蛋白表達，抑制膝關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡，可能是蠲痹顆粒治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機制之一。

蠲痹顆粒；膝骨關(guān)節(jié)炎；細胞凋亡；caspase-3；中成藥療法；痹證

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種關(guān)節(jié)退行性病變，指與遺傳、創(chuàng)傷、內(nèi)分泌、肥胖、年齡等多種因素相關(guān)的關(guān)節(jié)軟骨降解，并伴有軟骨皸裂、潰瘍、脫失的關(guān)節(jié)疾病，主要發(fā)生于老年人，75歲以上人群80%患有OA［1］，是最常見老年病。其發(fā)病與人體于中老年以后，中氣不足，氣血失和，肝腎漸虧，營衛(wèi)不和，或衛(wèi)陽虧虛，感受風寒濕邪外侵，閉阻經(jīng)脈有關(guān)，治療以溫陽、祛風、滲濕的藥物為主。

蠲痹顆粒為全國第二批名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師、云南省名老中醫(yī)吳生元教授在繼承著名中醫(yī)學(xué)家吳佩衡學(xué)術(shù)思想及臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上研究、總結(jié)而成，全方主要由附片、桂枝、麻黃、細辛、川芎、赤芍、羌活、黃芪等10余味藥物組成，具有溫陽通絡(luò)、祛風散寒除濕之功，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。故在蠲痹顆粒治療骨關(guān)節(jié)炎取得良好療效的基礎(chǔ)上，從調(diào)控caspase-3蛋白表達水平及對軟骨細胞凋亡影響的角度，闡明其防治膝OA發(fā)生發(fā)展的部分作用機理。

1 材料

1.1 動物健康新西蘭兔42只，6月齡，體重1.5～2.5 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2011-0004。

1.2 藥品蠲痹顆粒：規(guī)格15 g/袋（云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，滇藥制字〈Z〉20082554A）；雙醋瑞因膠囊：規(guī)格50 mg/粒，（昆明積大制藥股份有限公司，國藥準字J20100150）。

1.3 試劑和儀器原位凋亡檢測試劑盒（ROCHE公司），caspase-3抗體（ENZO公司）。DS-Fi2顯微鏡、石蠟切片機、BM-Ⅷ生物組織包埋機、CS-VI型攤片烤片機、自動脫水機、冷凍臺。

2 方法

2.1 兔膝OA模型制造蠲痹顆粒組、陽性藥（雙醋瑞因）組、KOA模型組均以改良Hulth法復(fù)制右膝OA模型。具體方法：丙戊酸鈉注射液（0.8～1.0 ml/kg）麻醉，將兔仰臥固定于手術(shù)臺，右膝關(guān)節(jié)局部脫毛、消毒，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2 cm，逐層切開或鈍性分離，找到內(nèi)側(cè)半月板后切除，顯露前交叉韌帶后切斷，手術(shù)時避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面，行抽屜試驗陽性后縫合術(shù)口，麻醉蘇醒后放回兔籠，使動物自由活動。術(shù)后1周內(nèi)每天肌肉注射青霉素鈉20萬u，每天追趕動物活動30分鐘。4周后開始治療。假手術(shù)組切開關(guān)節(jié)囊后縫合，不破壞關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)。

2.2 分組42只新西蘭兔隨機分為4組，即假手術(shù)組、膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）模型組各10只，蠲痹顆粒組、陽性藥（雙醋瑞因）組各11只。每組動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

2.3 給藥術(shù)后4周開始給藥，將藥物蠲痹顆粒及雙醋瑞因按兔與人用藥量以Meeh Rubner公式換算等效劑量。假手術(shù)組、KOA模型組以生理鹽水10mL灌胃，蠲痹顆粒組以5.4 g/（kg·d）（生藥6.16 g/（kg· d））的水溶液10 ml灌胃，陽性藥（雙醋瑞因）組予雙醋瑞因4.5 mg/（kg·d）溶于同體積蒸餾水，每日1次，給藥6周。

2.4 標本制備實驗第10周后，注入空氣法處死大白兔，打開關(guān)節(jié)腔，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)、色澤變化，取下右膝內(nèi)側(cè)脛骨軟骨組織，放入10%磷酸緩沖福爾馬林中固定。

2.5 指標檢測

2.5.1 HE染色固定48小時后，流水沖洗，放入10% EDTA中脫鈣，自動脫水機脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色，封片，顯微鏡下觀察。

2.5.2 免疫組化法檢測軟骨組織caspase-3蛋白表達水平切片脫蠟至水，PBS沖洗3次，3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉，滴加一抗（抗caspase-3）工作液，4℃孵化過夜，PBS沖洗3次，滴加生物素標記二抗工作液，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，滴加DAB顯色，蒸餾水終止顯色反應(yīng)，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染細胞20 s、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

2.5.3 TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡切片脫蠟至水，浸入蛋白酶K工作液15 min，配制TUNEL反應(yīng)混合液，PBS液沖洗2次，滴加50 μlTUNEL反應(yīng)液，加蓋，37℃下閉光和加濕反應(yīng)60 min，PBS漂洗玻片3次，滴加POD轉(zhuǎn)換液，PBS漂洗玻片3次，滴加DAB底物，PBS漂洗玻片，顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包，采用方差齊性檢驗后單因素方差分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計以（x±s）表示，以P＜0.05為顯著水平。

3 結(jié)果

3.1 HE染色軟骨組織鏡下觀察見圖1。

3.1.1 假手術(shù)組關(guān)節(jié)透明軟骨細胞分布均勻，排序整齊，各層細胞層次清晰，細胞飽滿，細胞核圓潤，底層（生發(fā)層）細胞較表層和中層細胞稍大，核漿比大，潮線完整。

3.1.2 模型組關(guān)節(jié)透明軟骨表面結(jié)締組織增厚，表層和中層軟骨細胞數(shù)減少，細胞排列紊亂，細胞核固縮變形，中層軟骨細胞柱狀排列消失，底層細胞與假手術(shù)組無明顯差異，潮線欠完整。

3.1.3 蠲痹顆粒組中層和底層軟骨細胞數(shù)量較模型組增多，排列不規(guī)則，細胞變飽滿，細胞核圓潤，底層細胞核漿比大，潮線完整。

3.1.4 陽性藥組中層和底層軟骨細胞數(shù)量較模型組增多，排列不規(guī)則，細胞變飽滿，細胞核圓潤，底層細胞核漿比大，潮線完整。

圖1 各組HE染色軟骨組織鏡下觀察

3.2 蠲痹顆粒對兔KOA關(guān)節(jié)軟骨細胞caspase-3表達結(jié)果切片中細胞胞漿呈棕色顆粒為caspase-3陽性細胞，即caspase-3表達，每張切片隨機選取5個400倍視野，以caspase-3陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例表示caspase-3陽性率。陽性率（%）=caspase-3陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。見表1。

表1 蠲痹顆粒對兔KOA模型caspase-3表達水平的影響（x±s）

3.3 蠲痹顆粒對兔KOA關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的影響切片中凋亡細胞核呈棕黃色顆粒，每張切片隨機選取5個400倍視野，以陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例表示細胞凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。見表2、圖2。

表2 蠲痹顆粒對兔KOA模型軟骨細胞凋亡水平的影響（x±s）

圖2 各組治療后切片細胞凋亡組織鏡下觀察

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞、骨質(zhì)增生為病理特征的慢性、進行性關(guān)節(jié)病變，病因病機尚不清楚，研究表明軟骨細胞凋亡、細胞外基質(zhì)的降解和軟骨下骨的再造是導(dǎo)致OA軟骨降解的主要原因［2］，而軟骨細胞凋亡在OA發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［3］。正常情況下，軟骨細胞凋亡是一個正常的現(xiàn)象，軟骨細胞的凋亡對于軟骨的成熟和形態(tài)維持有著重要的作用，一旦軟骨細胞凋亡過度，軟骨細胞數(shù)量減少，引起細胞外基質(zhì)合成減少，從而導(dǎo)致OA的發(fā)生。在軟骨細胞凋亡過程中，caspase家族起著非常重要的作用，因caspase-3在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中占據(jù)中樞位置，其活化與否決定了凋亡程序啟動［4-5］，活化的caspase-3降解細胞內(nèi)底物骨架蛋白、核蛋白、MEK激酶、PKA2等，通過細胞外和細胞內(nèi)途徑介導(dǎo)使細胞發(fā)生凋亡［6］。

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，《素問·痹論》：“風寒濕三氣雜至，合而為痹，其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹……病在陰者命曰痹”，骨關(guān)節(jié)炎主要好發(fā)于老年人，正如《素問·上古天真論》所云“丈夫……，五八，腎氣衰……；六八，陽氣衰竭于上……；七八，肝氣衰，筋不能動……。”步入老年后，人體機能減退，則肝腎不足、陽氣漸衰，陽氣失去維持正常的溫煦生理功能，不能固密衛(wèi)外，風寒濕相夾雜，侵襲機體，犯于經(jīng)絡(luò)、筋骨，邪氣壅塞而成痹，陽氣虧虛為發(fā)病的內(nèi)在病理基礎(chǔ)，故“陽虛外感風寒濕邪”是OA發(fā)生的關(guān)鍵病機所在。

蠲痹顆粒以附子辛苦大溫、大熱，通行十二經(jīng)，具有溫散寒濕、補火助陽之功為君藥，吳佩衡《醫(yī)藥簡述》：“附子溫暖水寒，補命門真火，回陽生津，驅(qū)逐陰寒，回陽救逆”；桂枝、麻黃、細辛等辛溫藥物，功擅“祛風散寒、溫經(jīng)通陽”，黃芪益氣固表，增強衛(wèi)陽之衛(wèi)外功能，川芎、赤芍活血通絡(luò)、散瘀止痛，使閉阻邪氣外出，經(jīng)絡(luò)通暢；配伍羌活、獨活、海風藤、透骨草等祛風濕，全方藥物配伍，共奏“溫陽散寒、祛風除濕”之功。部分研究還顯示黃芪能降低細胞凋亡率和Bim蛋白的表達，抵抗H2O2造成的體外軟骨細胞損傷［7］，川芎可促進軟骨細胞分泌合成代謝因子，刺激細胞增殖和蛋白質(zhì)合成［8］。附子、獨活、細辛有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用［9-11］。

本實驗研究表明，蠲痹顆粒能下調(diào)caspase-3表達，阻滯凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低軟骨細胞凋亡率，抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞過度凋亡。這可能是蠲痹顆粒延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，從而介導(dǎo)其對關(guān)節(jié)軟骨保護作用的有效機制。參考文獻

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The Influence of Juanbi Granule on Chondrocyte Apoptosis of Rabbit Knee Osteoarthritis

FANGChunfeng1，WU Yang2，LI Zhaofu3，LIU Tao4，LIU Weichao2，DI Pengtao2△
（1.Department of Pediatrics，Yunnan Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China；2.Department of Rheumatology，Yunnan provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China；3.Department of Science and Technology，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming650500，China；4.Department of Pathology，Yunnan Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China）

Objective To explore the influence of Juanbi granule on chondrocyte apoptosis of rabbit knee osteoarthritis，reveal partial treat mechanism of the osteoarthritis（OA），and provide the theory basis for treatment of OA.Methods 42 NewZeal and rabbits were used to establish improved Hulth model of knee OA.After the mould，the rabbits were randomly divided into control group，model group，Juanbi granule group and the positive drug group（double vinegar）.After six weeks intervention of drugs or physiological saline，the articular cartilage was removed.We observed the pathological morphological changes of HE dyeing cartilage tissue under the mirror，detected the caspase-3 expression level in chondrocytes by immunohistochemical method，and detected chondrocytes apoptosis by TUNEL method. Rusults The rabbit knee joint cartilage caspase-3 protein expression level and cartilage cell apoptosis rate of Juanbi granule group and positive medicine control group were significantly lower than those of the model group，and there was statistical significance（P＜0.05）. Conclusion Juanbi granule can cut the caspase-3 protein expression and cell apoptosis.This may be one of the mechanisms of Juanbi granule in treating osteoarthritis.

Juanbi granule；knee osteoarthritis；apoptosis；caspase-3；therapy of traditional Chinese medicine patent prescription；arthralgia syndrome

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.14.070

1672-2779（2015）-14-0136-03

：楊杰本文校對：湯小虎

2015-06-11）

國家中醫(yī)藥管理局云南吳佩衡扶陽學(xué)術(shù)流派工作室項目；云南省自然基金項目（No：2011FZ260）

*通訊作者：dipengtao88@126.com