董晶萊，高廣春，黃 嬛，李 白，李 軍*

（1.嘉興學院 醫(yī)學院，浙江 嘉興 314001；2.嘉興市農業(yè)科學研究院，浙江 嘉興 314016）

DNA條形碼技術在部分菱屬植物分子鑒定中的應用

董晶萊1，高廣春1，黃 嬛1，李 白2，李 軍2*

（1.嘉興學院 醫(yī)學院，浙江 嘉興 314001；2.嘉興市農業(yè)科學研究院，浙江 嘉興 314016）

為了彌補形態(tài)學鑒定方法的不足，本研究利用DNA條形碼技術，選取標準基因序列對部分菱屬植物進行初步的分子鑒定。通過對浙江、江蘇2省南湖菱、兩角菱、四角菱的ITS，matK和rbcL序列擴增及多重序列比對，探尋菱屬植物的分子鑒定方法。克隆了菱屬植物692 bp的ITS序列、878 bp的matK序列及685 bp的rbcL序列，其中matK和rbcL序列不存在變異位點，不能用于鑒定菱屬植物；ITS序列存在20個變異位點，包括6處插入/缺失和14處堿基置換，在部分菱屬植物的分子鑒定中具有應用價值。

菱屬；分子鑒定；DNA條形碼

菱科（Trapaceae）菱屬（Trapa L.）植物為一年生水生草本植物，在中國南方尤其以長江下游太湖地區(qū)和珠江三角洲栽培最多。菱果肉含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸及多種維生素和微量元素，菱殼具有抗食道癌、乳腺癌、子宮頸癌等藥用價值。菱屬植物包含多個栽培種和野生種，栽培種包括南湖菱（Trapa acornis Nakano）、四角菱（Trapa quadrispinosa Roxb）、二角菱 （Trapa bispinosa Roxb.）及烏菱（Trapa bicornis Osbeck）等；野生種包括野菱（Trapa incise var.Sieb.）、耳菱（Trapa potanini V.Vassil.）、冠菱（Trapa litwinowii V.Vassil.）、格菱（Trapa pseudoincisa Nakai.）及細果野菱（Trapa maχimowiczii Korsh）等［1-2］。菱屬植物的分類學研究多集中在常規(guī)的形態(tài)分類學、數量分類學、細胞分類學以及花粉形態(tài)學等方面［3-8］，不同分類方法對菱屬植物的聚類分析存在一定差異。由于菱屬植株的形態(tài)及果肉等營養(yǎng)形態(tài)基本相同，傳統(tǒng)的形態(tài)分類學方法在菱屬植物的鑒別上有局限性。近年來已有應用分子生物學方法研究菱屬植物親緣關系及分子鑒別的研究報道［1-2，9-12］，大多是利用 DNA指紋標記對菱屬植物進行分類及系統(tǒng)進化研究。鑒于菱在農業(yè)及醫(yī)藥領域的重要作用，及其種質混亂、鑒別方法不統(tǒng)一的現(xiàn)狀，對單一品種菱建立一套可靠的分子鑒定方法勢在必行。

DNA條形碼技術是利用標準的、具有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段，基于物種內的特異性和物種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)，可實現(xiàn)對物種的快速自動鑒定［13］，該技術已被成功應用于生物物種的分類和鑒定等領域［2，14-16］。常用的 DNA序列有 matK，trnH-psbA，rbcL和ITS等，通過單一片段或多片段組合的方式構建不同植物的 DNA條形碼標準［17］。

matK基因位于 trnK基因的內含子中，約1 500 bp，編碼一種成熟酶（matuease）。matK序列的變異較均一，變異中轉換和顛換以及密碼子3個位置的變異頻率沒有嚴重的偏離，增強了分子系統(tǒng)樹的可靠性［15］。rbcL基因編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶的大亞基，rbcL序列的變異主要存在于種以上水平，物種水平上通常變異不大，其變異位點較均勻地分布于整個基因上［17］。核糖體DNA ITS（18S-5.8S-26S）片段廣泛分布于真核生物和真菌中，是系統(tǒng)學研究中最常用的片段之一，常用作種水平區(qū)分的片段［2］。因此，本研究以浙江省和江蘇省的栽培種南湖菱、四角菱及二角菱為研究材料，選取matK，rbcL和ITS序列對菱屬植物進行分子鑒定，為菱屬植物的鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗所用材料包括浙江嘉興的南湖菱 （T. acornis Nakano），果皮綠白色，試驗編號為T1-1；浙江溫州和江蘇南京的二角菱（T.bispinosa Roxb），果皮暗紫色，試驗編號為T2-1和 T2-2；浙江嘉興和江蘇南京的四角菱（T.quadrispinosa Roxb），果皮分別為水紅色和綠色，試驗編號分別為T3-1和T3-2。菱角種類的鑒定參照中國菱屬植物分類方法［18-19］。

DNA聚合酶和dNTPs等購于寶生物工程 （大連）有限公司，引物和PCR產物測序委托英濰捷基 （上海）貿易有限公司完成。

1.2 總DNA提取和PCR擴增

總DNA提取方法：用清水洗凈菱角果實，解剖刀快速取出菱胚，每個測試樣品分別取5個菱胚進行混合，用 CTAB法提取總DNA［20］，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

用于PCR反應的ITS，matK和rbcL序列引物分別：ITS-F為5＇-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3＇，ITS-R為5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇；matK-F為5＇-CGATCTATTCATTCAATATTTC-3＇，matK-R為5＇-TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3＇；rbcL-F為5＇-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3＇，rbcL-R為5＇-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3＇。

克隆ITS序列的PCR反應體系為20μL，2× GC buffer I 10μL、dNTPs（2.5 mmol·m L-1）0.5μL、上下游引物 （10μmol·m L-1）各0.5μL、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、ddH2O 7.3μL。反應條件為94℃預變性3 min；然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 m in，共36個循環(huán)；最后72℃延伸5 m in，4℃保存。matK和rbcL序列的PCR反應體系為20μL，10× PCR buffer 2μL、dNTPs（2.5 mmol·m L-1）0.5μL、上下游引物（10μmol·m L-1）各0.5μL、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、ddH2O 15.3μL。反應條件為94℃預變性3 min；然后94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共36個循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后割膠回收目的條帶，送英濰捷基 （上海）貿易有限公司進行回收、純化及測序。

1.3 序列分析及多重比對

分別將ITS、matK和rbcL序列在NCBI進行Blast分析，用DNAMAN軟件進行多重序列比對，然后用MEGA 4.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 ITS序列擴增及比對

通過PCR擴增，5個測試樣品均獲得了692 bp的ITS序列 （圖1），序列分析表明ITS序列包含262 bp的ITS1序列、166 bp的5.8S rDNA序列及264 bp的ITS2序列。序列比對表明，5個測試樣品的ITS序列相似度達95%以上，（G+C）含量偏高。南湖菱ITS序列 （G+C）含量為58.96%，（A+T）含量為41.04%。

圖1 菱屬植物ITS序列引物PCR結果

通過GenBank數據庫檢索，獲得9個菱屬植物的ITS序列：江蘇蘇州四角菱 （AY315464）、江蘇泰州四角菱 （AY315466）、江蘇南通二角菱（AY315465）、安徽蕪湖二角菱 （AY315468）、江蘇南通烏菱 （AY315463）、安徽蕪湖烏菱（AY315470）、江蘇南京野菱 （AY315462）、湖北梁子湖細果野菱 （AY035757）及歐菱 （FM887019）的ITS序列。多重序列比對表明，ITS序列存在20個變異位點 （圖2），其中6處插入/缺失和10處堿基置換位于ITS1序列，4處堿基置換位于ITS2序列，5.8S rDNA序列中不存在變異位點。6處插入/缺失分別位于第17，18，71，107，130和207 bp處；14處堿基置換分別為12 bp（A?G），15 bp（A?G），36 bp（A?G），63 bp（C?T），482 bp（T?C），508 bp（A?G），606 bp（A?G）的轉換和9 bp（T?G）、10 bp（C?G）、11 bp（A?C）、67 bp（T?G）、134 bp（C?G）、201 bp（T?G）、448 bp（T?G）的顛換。本試驗的5個測試樣品僅在第36 bp及67 bp處有差異 （圖2），浙江溫州二角菱在第36 bp為 “G”，其余4種菱均為 “A”；浙江溫州二角菱和浙江嘉興四角紅菱在第67 bp為 “G”，其余3種菱角為 “T”。

圖2 不同種菱屬植物的ITS序列比對

2.2 matK基因擴增及序列比對PCR擴增及測序結果表明，5個測試樣品都獲得了878 bp的matK序列 （圖3），樣品間序列相似度為100%。統(tǒng)計分析表明，菱屬植物的matK序列 （G+C）含量偏低，為32.80%， （A+T）含量為67.20%。GeneBank中尚未有菱屬植物的matK基因登錄，通過Blast檢索到海?？?、千屈菜科等科屬植物的matK基因序列與本試驗克隆的matK序列相似度達95%以上。用MEGA 4.1軟件構建matK序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明，在matK序列涉及到的植物中，菱屬植物與海?？浦参镉H緣關系最近，與千屈菜科植物次之，與桃金娘科植物親緣關系最遠 （圖4）。

圖3 菱屬植物matK及rbcL序列PCR結果

圖4 菱屬植物與其他物種的matK序列系統(tǒng)進化樹

2.3 rbcL基因擴增及序列比對

5個測試樣品都獲得了685 bp的rbcL序列片段 （圖3），樣品間序列相似度為100%，（G+C）含量為41.17%，（A+T）含量為58.83%。將克隆的rbcL序列與GeneBank數據庫中歐菱和細果野菱的序列進行序列比對發(fā)現(xiàn) （圖5），rbcL序列存在5個變異位點，包括1處插入/缺失和4處堿基置換，1處插入/缺失位于10 bp處，4處堿基置換包括第109 bp和110 bp處的2處堿基顛換，4 bp和111 bp處的2處堿基轉換。

圖5 菱角與歐菱和細果野菱的rbcL序列比對

3 小結和討論

自加拿大動物學家Paul Hebert［21］于2003年首次提出DNA條形碼的概念以來，該研究已成為生物分類學研究的熱點和前沿。該技術利用基因組中一段通用的標準短序列進行物種鑒定，現(xiàn)已提出10多條植物候選DNA條形碼序列，其中以ITS，matK，rbcL及trnH-psbA的單一片段或幾個片段的組合應用較多［22］。 現(xiàn)已在胡椒屬［16］、 錦葵科［15］、忍冬科［23］、 石斛屬［24］、 重樓屬［14］等植物的系統(tǒng)進化及分類鑒定中得到廣泛應用，同時也在藥用植物藏藥雪蓮［25］、 女貞子［26］、 杜仲［27］等基原植物的分子鑒定中得到應用。

本研究以南湖菱、二角菱和四角菱為研究材料，克隆ITS、matK及rbcL序列，通過多重序列比對，找尋菱屬植物序列變異位點。在測試的3個DNA條形碼序列中，ITS序列變異位點較多，有20個，均位于ITS1和ITS2序列，包括6處插入/缺失和14處堿基置換，5.8S rDNA序列中不存在變異位點，這與保曙琳等［2］的研究報道一致。由于rDNA比cpDNA具有更快的進化速率，而且不存在cpDNA的母系單向遺傳問題，所以rDNA ITS序列是近年來用于探討植物種內變異和種間、近緣屬間分子系統(tǒng)關系的重要分子標記之一，已被廣泛應用于胡椒屬、錦葵科、石斛屬及重樓屬等科屬植物的分子鑒定研究中［2］。據保曙琳等［2］的研究報道，南湖菱與二角菱在ITS序列中的鑒別位點在508號堿基上，南湖菱為 “G”，二角菱為 “A”。本研究結果表明，在第508號堿基上，除來源于江蘇南通的二角菱 （GenBank登錄號AY315465）為“A”外，包括南湖菱在內的其余菱均為 “G”，因此，ITS序列第508號堿基是否能作為鑒別南湖菱與二角菱的位點還有待進一步擴大采樣地點及樣本數量來分析。測試樣品中matK和rbcL序列不存在變異位點，不能用來鑒定菱屬植物。

本試驗的5個研究材料涉及南湖菱、四角菱及二角菱3個種，均為栽培種，各種之間的差異為種內差異。ITS序列變異位點分析表明，3個種之間具有較高的遺傳穩(wěn)定性，ITS序列在菱屬植物種內分子鑒定及系統(tǒng)進化分析中具有重要的應用價值。

［1］ 姜維梅，丁炳揚.國產菱屬植物親緣關系的RAPD分析［J］.浙江大學學報：農業(yè)與生命科學版，2004，30（2）：191-196.

［2］ 保曙琳，丁小余，?？?，等.長江中下游地區(qū)菱屬植物的DNA分子鑒別 ［J］.中草藥，2004，35（8）：926-930.

［3］ Kadono Y.A preliminary study on the variation of Trapa in Japan［J］.Acta Phytoax Geobot，1987，38：199-210.

［4］ 于丹.中國東北菱屬植物的研究 ［J］.植物研究，1994，14（1）：40-47.

［5］ 胡仁勇，丁炳揚，黃濤，等.國產菱屬植物數量分類學研究 ［J］.浙江大學學報：農業(yè)與生命科學版，2001，27（4）：419-423.

［6］ 陳家寬，周進.湖北斧頭湖浮葉水生植物群落學研究：I.菱群落的結構 ［J］.水生生物學報，1995，19 （1）：40-48.

［7］ 丁炳揚，黃濤，姜維梅，等.菱屬植物的幼苗形態(tài)及其系統(tǒng)學意義 ［J］.浙江大學學報：自然科學版，1999，26（3）：92-98.

［8］ Shalabh B，Akash J，Jasm ine C.Trapa natans（Water Chestnut）：an overview［J］.International Research Journal of Pharmacy，2012，3（6）：31-33.

［9］ Hoque A，Anai T，Arima S.Analysis of molecular diversity in water chestnut based on RAPD markers［J］.Biotechnology，2005，4（2）：144-148.

［10］ Huang Y L，Shi SH.Phylogenetics of Lythraceae sensu lato：a preliminary analysis based on chloroplast rbcL gene，psaA-ycf3 spacer，and nuclear rDNA in ternal transcribed spacer（ITS）sequences［J］.International Journal of Plant Sciences，2002，163（2）：215-225.

［11］ Graham S A，Hall J，Sytsma K，et al.Phylogenetic analysis of the Lythraceae based on four gene regions and morphology［J］. International Jou rnal of Plant Sciences，2005，166（6）：995-1017.

［12］ Kim C，Na H R，Choi H K.Molecular genotyping of Trapa bispinosa and T.japonica（Trapaceae）based on nuclear AP2and chloroplast DNA trnL-F region［J］.American Journal of Botany，2010，97（12）：e149-e152.

［13］ 任保青，陳之瑞.植物DNA條形碼技術 ［J］.植物學報，2010，45（1）：1-12.

［14］ 朱英杰，陳士林，姚輝，等.重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究 ［J］.藥學學報，2010，45（3）：376-382.

［15］ 王柯，陳科力，劉震，等.錦葵科植物DNA條形碼通用序列的篩選 ［J］.植物學報，2011，46（3）：276-284.

［16］ 郝朝運，鄔華松，范睿，等.胡椒屬植物 DNA條形碼初步研究 ［J］.熱帶作物學報，2013，34（5）：870-874.

［17］ 高連明，劉杰，蔡杰，等.關于植物 DNA條形碼研究技術規(guī)范 ［J］.植物分類與資源學報，2013，34（6）：592-606.

［18］ 顏素珠.中國水生高等植物圖說 ［M］.北京：科學出版社，1983，121-130.

［19］ 萬文豪.中國菱屬植物分類研究 ［J］.江西大學學報：自然科學版，1984（2）：71-78.

［20］ Doyle J J.A rap id DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］.Phytochem ical Bulletin，1987，19：11-15.

［21］ Hebert P D N，Ratnasingham S，de Waard J R.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit1 divergences among closely related species［J］.Proceedings of the Royal Society of London B：Biological Sciences，2003，270（Suppl 1）：S96-S99.

［22］ 寧淑萍，顏海飛，郝剛，等.植物DNA條形碼研究進展［J］.生物多樣性，2008，16（5）：417-425.

［23］ 劉震，陳科力，羅焜，等.忍冬科藥用植物 DNA條形碼通用序列的篩選 ［J］.中國中藥雜志，2010，35（19）：2527-2532.

［24］ 黃海，李勁松，符岸軍，等.石斛屬植物DNA條形碼序列的篩選 ［J］.熱帶作物學報，2010，31（10）：1769-1777.

［25］ 劉建全，陳之瑞，路安民.藏藥雪蓮原植物水母雪蓮及其混淆種類的 ITS序列比較和分子鑒定 ［J］.中草藥，2001，32（5）：443-445.

［26］ 李美妮，韓蕊蓮，韓建萍，等.基于ITS2序列的女貞子原植物及其混偽品的分子鑒定 ［J］.世界科學技術：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（4）：644-649.

［27］ 章群.中藥杜仲原植物的分子鑒定 ［J］.生態(tài)科學，2004，23（2）：141-143.

（責任編輯：侯春曉）

S567.21+9

A

0528-9017（2015）04-0530-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20150427

2014-11-24

嘉興市科技計劃項目 （2013AY21047）；十二五浙江省高校重點學科 （藥理學）；2011年嘉興市重點科技創(chuàng)新團隊——天然藥物與健康食品研發(fā)技術；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目 （201410354021）

董晶萊（1992-），女，本科生。E-mail：gaogcjx@163.com。

李 軍。E-mail：lijun jx1@163.com。

文獻著錄格式：董晶萊，高廣春，黃嬛，等.DNA條形碼技術在部分菱屬植物分子鑒定中的應用 ［J］.浙江農業(yè)科學，2015，56（4）：530-533，557.