宋姝婧，許牡丹，王曉拓，王志東

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100000）

果蔬產(chǎn)品在采后會(huì)發(fā)生一系列生理病理的變化，冬棗在貯藏后期隨著果實(shí)的成熟衰老，其抗病性也逐漸降低，腐爛率也大大增加。傳統(tǒng)的冬棗保鮮所采用的都是成本低廉、使用方便、效果顯著的化學(xué)殺菌劑，但是大規(guī)模地使用化學(xué)殺菌劑不僅會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)造成果蔬的農(nóng)藥殘留和污染環(huán)境［1］，這與現(xiàn)如今人們所追求的綠色、環(huán)保以及吃健康食品的觀念背道而馳。因此研究開(kāi)發(fā)無(wú)毒、高效的天然防腐保鮮劑已成為一項(xiàng)極為迫切的任務(wù)。

近年來(lái)，植物精油以其顯著的抑菌活性和廣泛的抗菌譜范圍，以及與化學(xué)抑菌劑相比副作用和殘留毒性小的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在抑菌研究方面得到了廣泛的關(guān)注，被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)天然防腐保鮮劑的重要原料［2，3］。目前植物精油對(duì)冬棗主要采后致病菌的抑制效果研究較少，冬棗精油天然防腐保鮮劑的開(kāi)發(fā)也鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以陜西地區(qū)冬棗采后貯藏中分離鑒定的病原菌作為供試菌種，對(duì)5 種天然植物精油（羅勒精油、薰衣草精油、紅百里香精油、松紅梅精油、迷迭香精油）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選可有效抑制病原菌的植物精油，為冬棗采后病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬棗為陜西渭南市售的在半紅期采摘的果實(shí)，挑選無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械傷的鮮果用流動(dòng)水沖洗，表面自然瀝干，置于室溫進(jìn)行貯藏，讓其在貯藏的過(guò)程中病變。

植物精油羅勒精油、薰衣草精油、紅百里香精油、松紅梅精油和迷迭香精油均購(gòu)自上海雅琪實(shí)業(yè)有限公司，試驗(yàn)前置于低溫（4 ℃）避光環(huán)境下保存。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采用常規(guī)方法，在PDA 培養(yǎng)基中分離病原菌，待產(chǎn)孢后對(duì)病原菌孢子進(jìn)行濃度梯度稀釋，涂于平皿，并在28 ℃培養(yǎng)2d后于倒置顯微鏡下挑取單孢子，移入另一裝有PDA 的平皿，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后，即得純化菌株。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌懸液的制備 挑取各菌落接種到平皿上，進(jìn)行培養(yǎng)，然后用無(wú)菌生理鹽水洗脫，分別制成含菌約為1 mL 106 個(gè)菌的菌懸液，備用。霉菌、酵母菌使用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測(cè)菌體個(gè)數(shù)［4，5］。

1.2.3 濾紙片法測(cè)定抑菌圈 選擇吸水性強(qiáng)的定性濾紙，用打孔器打成若干直徑為6 mm的圓形濾紙片，放入電熱干燥箱中經(jīng)160 ℃干熱滅菌2h后，把滅好菌的濾紙片放入植物精油中浸漬4h，取出濾紙片放在無(wú)菌的條件下瀝干備用。將活化并調(diào)整好菌液濃度的酵母菌菌懸液0.1 mL 加入已經(jīng)倒好的YPD 培養(yǎng)基平皿中，根霉菌倒入察氏培養(yǎng)基平皿上，并涂布均勻。取浸泡過(guò)精油的濾紙片貼在含菌平皿上，每皿平行做3片，每種菌平行做3個(gè)皿。然后用相應(yīng)的提取溶劑作陰性對(duì)照，用青霉素G作陽(yáng)性對(duì)照。酵母菌、根霉菌置培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)48h。選取抑菌圈比較明顯的平板，用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)的直徑，結(jié)果取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值［6-8］。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 在無(wú)菌條件下，將植物精油稀釋成下列不同濃度梯度：200、100、50、25、12.5、6.25μL／mL。吸取各濃度稀釋液1mL，分別加到已滅菌的9mL PDA培養(yǎng)基中制成帶藥的平皿，編號(hào)后吸取待測(cè)菌種的懸浮液100μL 于平皿表面，涂布均勻，酵母菌、根霉菌置于恒溫箱28 ℃下培養(yǎng)48h，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為該精油的最低抑菌濃度（MIC）［9，10］。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 將在測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)中沒(méi)有長(zhǎng)菌的平皿繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出觀察，以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的為最低殺菌濃度（MBC）［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬棗病原菌鑒定

從貯藏的冬棗果實(shí)上分離出兩種病原菌，挑取各菌落少許到載玻片上，用顯微鏡觀察、測(cè)量，根據(jù)各病原菌的形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行鑒定。經(jīng)過(guò)鑒定冬棗上分離出的兩種病原菌是酵母菌和根霉菌。

酵母菌菌落呈現(xiàn)乳白色，少數(shù)為紅色，表面光滑濕潤(rùn)，質(zhì)地柔軟不透明，菌落直徑為1～2mm。孢子為圓形，單生或成串。

根霉菌菌落呈圓形，初形成時(shí)為灰白色和黃白色，成熟后變?yōu)楹谏橘刖z弧形，無(wú)色，向四周蔓延。孢子囊剛出現(xiàn)時(shí)為黃白色，成熟后變?yōu)楹谏?/p>

2.2 5種植物精油對(duì)冬棗病原菌抑制效果

2.2.1 抑菌圈的大小 5種植物精油、無(wú)菌生理鹽水和青霉素G 對(duì)冬棗病原菌的抑菌作用如表1。參照李春美等［12］抑菌實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)（抑菌圈直徑大于15 mm 為最敏感，10～15mm時(shí)為中度敏感，7～9 mm 為低度敏感，無(wú)抑菌圈者不敏感），認(rèn)為5種植物精油中紅百里香精油對(duì)兩種病原菌表現(xiàn)出了最強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑均大于20mm，屬最敏感；羅勒精油對(duì)根霉菌的抑制作用僅次于紅百里香精油，也屬最敏感，而對(duì)酵母菌屬于中度敏感；薰衣草精油、松紅梅精油對(duì)酵母菌的抑菌圈直徑介于7～9 mm，屬低度敏感，而這兩種精油對(duì)根霉菌屬中度敏感；迷迭香精油對(duì)酵母菌屬低度敏感，而對(duì)根霉菌屬中度敏感。綜合比較來(lái)看，5種精油對(duì)根霉菌的抑制作用要強(qiáng)于對(duì)酵母菌的抑制作用。

表1 植物精油對(duì)冬棗病原菌的抑菌圈直徑 ／mm

2.2.2 5種植物精油MIC 的測(cè)定 表2列出了供試菌種在不同精油濃度下生長(zhǎng)狀況和MIC值，精油的MIC 值越小，說(shuō)明精油抑制作用越強(qiáng)。從表3中可以看出，酵母菌和根霉菌在不同濃度的精油作用下，生長(zhǎng)狀況差異明顯，試驗(yàn)所得到的MIC值與濾紙片法所得到的結(jié)果是基本一致的。紅百里香精油對(duì)酵母菌和根霉菌都表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.625μL／mL；而羅勒精油對(duì)根霉菌表現(xiàn)出的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)酵母菌所表現(xiàn)的抑制作用，對(duì)酵母菌的MIC是10μL／mL，對(duì)根霉菌的MIC是1.25μL／mL；松紅梅精油和迷迭香精油對(duì)根霉菌抑菌作用較弱，而對(duì)于酵母菌的抑制作用極小，超出了實(shí)驗(yàn)所設(shè)的濃度梯次范圍；迷迭香精油對(duì)根霉菌的 MIC 為20μL／mL；薰衣草精油對(duì)酵母菌和根霉菌也都表現(xiàn)出了一定的抑制作用，對(duì)酵母菌的MIC 為20μL／mL，對(duì)根霉菌的MIC為10μL／mL。

表2 植物精油對(duì)供試菌種的抑菌濃度 ／（μL／mL）

2.2.3 5種植物精油MBC的測(cè)定 表3列出了供試菌種在不同精油濃度下生長(zhǎng)狀況和MBC值。從表3中可以看出，紅百里香精油對(duì)酵母菌和根霉菌都表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的殺菌能力，紅百里香精油對(duì)酵母菌和根霉菌的MBC 值分別是1.25μL／mL 和2.5μL／mL，為5種植物精油中最低的殺菌濃度；相對(duì)酵母菌，羅勒精油對(duì)根霉菌表現(xiàn)出了更強(qiáng)的殺菌能力，MBC 值分別為20μL／mL 和5μL／mL；其余幾種精油對(duì)供試菌的殺菌能力都比較弱。

表3 植物精油對(duì)供試菌種的殺菌濃度 ／（μL／mL）

3 結(jié)論

對(duì)貯藏的病變冬棗上的病原菌進(jìn)行分離、提純、鑒定，結(jié)果表明導(dǎo)致冬棗病變的主要病原菌為酵母菌和根霉菌。5種植物精油均對(duì)酵母菌、根霉菌有一定的抑制能力，其中紅百里香精油對(duì)酵母菌和根霉菌有著最強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑分別為（22.43±0.06）mm、（23.48±0.06）mm。紅百里香精油對(duì)酵母菌的MIC 值是0.625μL／mL，MBC 值是1.25μL／mL，對(duì)根霉菌的MIC 是0.625μL／mL，MBC 值是2.5μL／mL。另外，5 種植物精油均表現(xiàn)出對(duì)根霉菌的抑制效果強(qiáng)于酵母菌的特點(diǎn)，其作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。綜上，紅百里香精油對(duì)冬棗采后病原菌有很強(qiáng)的抑制能力，可作為開(kāi)發(fā)冬棗天然防腐保鮮劑的重要原料，關(guān)于其對(duì)冬棗的保鮮防腐效果尚需具體研究，使其更具實(shí)際應(yīng)用性。

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