賀荔枝，尹 明，王真權*

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種原因不明的慢性直腸和結腸炎性疾病，臨床表現(xiàn)主要為腹瀉、腹痛、黏液膿血便，病變主要位于結腸黏膜及黏膜下層，中醫(yī)藥治療UC 有一定優(yōu)勢[1]。 復方芩柏顆粒劑有清熱祛濕之功效，是我院臨床應用近20年并已獲國家知識產(chǎn)權局專利保護的自制藥，在前期的研究中， 證實復方芩柏顆粒劑對治療UC 大鼠具有確切的療效[2-4]。 有研究[5]發(fā)現(xiàn)影響機體水液代謝的水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）與濕病關系密切， 推測AQPs 的表達失?？赡苁荱C 的病理機制之一。 正所謂“無濕不成泄”，本實驗選取有清熱利濕之功效的復方芩柏顆粒劑干預治療UC 模型大鼠， 通過免疫組化法檢測UC 大鼠結腸黏膜AQP4、AQP8 的表達水平， 初步探討復方芩柏顆粒劑治療大鼠的部分作用機制及AQPs 的表達與UC 的相關性， 探尋中醫(yī)祛濕理論與水液代謝理論的關聯(lián)性，為中醫(yī)藥治療UC 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與儀器

SPF 級SD 大鼠80 只， 雄性， 體 質量180～200 g，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(湘)2011-0003；JY3002 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；Leica DM LB2 型雙目顯微鏡（德國Leica 公司）；MIAS 醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北航公司）；Shandon325 型石蠟切片機（英國Shandon 公司）；Motic B5 顯微攝像系統(tǒng) （麥克奧迪實業(yè)集團公司）等。

1.2 藥物及試劑

將中成藥復方芩柏顆粒劑（由黃芩、黃柏、制大黃、秦艽、防風、澤瀉、當歸、桃仁、生地黃、檳榔、延胡索11 味中藥組成，由湖南省中醫(yī)院藥劑科制備，規(guī)格：6 g/包，產(chǎn)品批號：20130924）6 g 溶于100 mL蒸餾水中制成6%芩柏顆粒劑溶液（60 mg/mL）。 因成人灌腸用藥劑量為6 g/d， 按成人體質量70 kg、實驗大鼠體質量為180～200 g 參照常用實驗大鼠與人的體表面積比值（R）表計算，每只大鼠每日給藥劑量為108 mg （即大鼠給藥量為0.54 g/kg），奧沙拉秦鈉膠囊 （天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：1311004）， 參照常用實驗動物與人的體表面積比值（R）表計算，每只大鼠每日給藥劑量為36 mg(即大鼠給藥量為0.18 g/kg)。

其他試劑：5%三硝基苯磺酸 (TNBS，Sigma 生產(chǎn))；無水乙醇、4%多聚甲醛溶液、二甲苯、蘇木素染液、伊紅水液、中性樹膠（由湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學基礎實驗室中心提供）；AQP4 多克隆抗體 （武漢博士德生物工程有限公司， 批號：1401132）、AQP8 多克隆抗體 （武漢博士德生物工程有限公司， 批號：1401081）、SABC 免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：1312061）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將大鼠隨機編號，常規(guī)飼養(yǎng)1 周后隨機選取20 只大鼠作為正常組， 余下大鼠進行造模，造模成功后，再隨機將60 只UC 模型大鼠分為3 組： 模型組、奧沙拉秦鈉組（簡稱西藥組）和復方芩柏顆粒劑組(簡稱中藥組)，每組20 只。

1.3.2 動物造模及給藥方法 參照Morris 等[6]及陳英群等[7]方法建立與人類UC 結腸黏膜病理組化相近的UC 大鼠模型。 實驗前，大鼠禁食不禁水24 h，用棉簽刺激大鼠肛門排出大便。 實驗時，先用10%的水合氯醛(3 mL／kg 劑量)使大鼠輕微麻醉，而后將一直徑2 mm、 長約12 cm 的硅膠輸液管用石蠟油充分潤滑后輕緩插入大鼠腸腔內(nèi)，進入深度大約8 cm，繼而把TNBS(100 mg／kg)和50%乙醇溶液(1∶1，v／v)0.25 mL 溶液一次性由硅膠管內(nèi)注入，提起大鼠尾部，將其持續(xù)倒置約5 min。 造模后，使動物保持平躺，自然清醒，自由飲食。 在同一操作條件下，正常組大鼠腸腔內(nèi)注入等體積生理鹽水。造模第1、2 天，大鼠相繼出現(xiàn)精神倦怠，懶于活動，拱背扎堆，飲食減少，糞便性狀改變（大便稀溏、末端大便有黏液或膿點）等表現(xiàn)。 造模后第3 天，隨機抽取兩只大鼠處死，迅速剖腹，分離結腸，沿腸系膜緣剪開腸腔，冰生理鹽水沖洗，距肛門約8 cm 處可見明顯糜爛及潰瘍面，組織學檢查確認有充血、水腫、炎性細胞浸潤、 腺體破壞及典型的潰瘍形成等病理學改變，證實造模成功。

造模成功后第3 天， 各組大鼠開始灌腸給藥：西藥組以奧沙拉秦鈉溶液1.8 mL 灌腸； 中藥組以6%復方芩柏顆粒劑溶液1.8 mL 灌腸； 模型組和正常組開始以等體積生理鹽水1.8 mL 灌腸， 每天1次，連續(xù)灌腸治療3 周。

1.4 標本取材及檢測指標

治療結束（3 周）后處死大鼠，迅速將其剖腹，剪取肉眼觀察病變最明顯的結腸標本， 用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。 采用免疫組化法檢測各組大鼠結腸組織中AQP4、AQP8 的表達。 記錄平均每1 000個細胞中的陽性細胞數(shù)、平均光密度（每張切片選3～5個不重疊視野， 測定每個視野的平均光密度， 其中細胞質或細胞膜中顏色為淺黃色至棕黃色或褐色者表示為陽性）， 對AQP4、AQP8 蛋白進行半定量分析，在400 倍光鏡下進行觀察，采用顯微鏡成像系統(tǒng)，用MIAS 醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)分析。 以陽性細胞染色的個數(shù)及平均光密度值表示抗原的表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠結腸黏膜AQP4、AQP8 的表達

AQP4 在正常組、模型組、西藥組及中藥組的免疫陽性表達物為棕黃色顆粒，主要表達在結腸的黏膜頂部的吸收細胞，在其基底部及腔面可見棕黃色陽性反應顆粒，胞質內(nèi)則可見極少數(shù)。 模型組大鼠結腸黏膜中AQP4 的陽性表達細胞明顯減少； 西藥組及中藥組大鼠結腸黏膜中AQP4 的陽性表達細胞明顯增多。 見封三彩圖圖1。

AQP8 主要表達在結腸上皮細胞的頂膜和基側膜，以及基底腺體胞漿也可見棕黃色免疫陽性反應顆粒。模型組大鼠結腸黏膜中AQP8 陽性表達細胞明顯減少； 西藥組及中藥組大鼠大腸黏膜中AQP8陽性表達細胞明顯增多。 見封三彩圖圖2。

2.2 各組大鼠結腸黏膜AQP4、AQP8 的陽性細胞數(shù)及平均光密度值比較

與正常組比較， 模型組結腸組織AQP4、AQP8陽性細胞數(shù)及平均光密度值明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組、中藥組結腸組織AQP4、AQP8 陽性細胞數(shù)及平均光密度均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠結腸組織AQP4、AQP8 蛋白表達的比較（±s，n=20）

表1 各組大鼠結腸組織AQP4、AQP8 蛋白表達的比較（±s，n=20）

注：與正常組比較**P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01。

組 別正常組模型組西藥組中藥組陽性細胞數(shù)146.59±10.10 64.50±7.41**129.42±7.74▲▲124.42±8.97▲▲平均光密度0.55±0.14 0.35±0.09**0.44±0.07▲▲0.48±0.07▲▲陽性細胞數(shù)245.50±17.93 74.90±7.91**140.58±18.35▲▲148.25±7.45▲▲平均光密度0.56±0.10 0.38±0.10**0.46±0.09▲▲0.47±0.08▲▲AQP4 AQP8

3 討論

水通道蛋白[8]是細胞膜上與水通透密切相關、對水專一的具有高度選擇性的糖蛋白，廣泛分布于人體的肺、胃、腸、腎、腦等器官，參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外水的平衡，在機體水平衡和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。 祖國醫(yī)學認為肺、脾、腎、大腸、小腸等臟腑在人體的水液代謝中發(fā)揮著重要作用，提示AQPs 與中醫(yī)理論的肺、脾、腎、大腸、小腸等臟腑功能密切相關。 近年來已有文獻證實結腸組織AQPs 的分布與腸道水液代謝異常性疾病有密不可分的關系： 如便秘患者結腸黏膜AQP4 出現(xiàn)高表達[9]，在便秘模型小鼠結腸組織中發(fā)現(xiàn)AQP4、AQP8的表達水平也較正常組偏高[10]，說明AQPs 的高表達加速了腸道水分的吸收， 成為便秘的病因之一；濕熱型泄瀉腸易激綜合征模型大鼠結腸組織的AQP4 出現(xiàn)低表達[11]、脾虛肝旺型腸易激綜合征模型大鼠(腹瀉型)的結腸組織出現(xiàn)AQP8 低表達[12]；脾陽虛型腹瀉模型大鼠結腸組織出現(xiàn)AQP4 低表達[13]、五苓散可通過上調(diào)腹瀉模型大鼠結腸AQP4的表達而達到止瀉目的[14]，均證明因AQPs 的低表達降低了腸道對水分的吸收而導致腹瀉。 涉及UC的報道較少，已有研究[15]證實脾虛濕困型UC 大鼠的結腸組織中AQP4 出現(xiàn)低表達， 參苓白術散能增強脾虛濕困型UC 大鼠結腸組織中AQP4 的表達，促進機體水液代謝功能的恢復。 UC 以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主癥， 腹瀉狀態(tài)下大鼠結腸AQPs 表達下調(diào)，結腸對腸腔內(nèi)水分的吸收減少，大便稀薄，含水量增加形成腹瀉。 由此可見，AQPs 表達量的變化可能參與了腸道水代謝紊亂性疾病的病理生理過程，與濕阻中焦、脾胃濕熱、脾虛濕困等濕性病證有密不可分的聯(lián)系。

在前期的研究[2-4]中，通過對UC 大鼠結腸組織的形態(tài)學評分、 病理切片的組織學評分以及IL-2、NF-κB p65 的表達進行分析，證實復方芩柏顆粒劑能減輕結腸組織的炎癥損傷， 能有效改善UC 大鼠的排便情況。 實驗結束后，模型組部分大鼠大便為稀便，部分有不同程度膿血便，體質量較實驗前下降；西藥組部分大鼠糞便性狀恢復正常，部分大鼠仍表現(xiàn)為稀便， 大鼠體質量較實驗前有所增加；中藥組大鼠大便呈顆粒狀或軟便，大鼠體質量較實驗前有一定增加。 本實驗采用TNBS 法結合乙醇復合物灌腸法制備UC 模型大鼠，通過免疫組化法對UC大鼠結腸組織中AQP4、AQP8 的表達進行檢測，結果顯示模型組大鼠結腸黏膜AQP4、AQP8 均出現(xiàn)低表達，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)，提示AQPs 表達的減少導致結腸黏膜對水的重吸收不足進而引起腹瀉； 中藥組大鼠結腸黏膜AQP4、AQP8 陽性表達細胞較模型組顯著升高， 其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)，提示復方芩柏顆粒劑可能通過上調(diào)UC 大鼠結腸AQP4、AQP8 的表達， 促進結腸組織水液代謝功能的恢復， 減少結腸內(nèi)水含量，緩解腹瀉癥狀，從而達到治療作用。 本實驗選取具清熱祛濕之功的復方芩柏顆粒劑治療UC 大鼠，方中黃芩、黃柏為君藥，有清熱燥濕，瀉火解毒之功；防風、秦艽祛風勝濕，澤瀉利水滲濕共為臣藥；生地黃清熱涼血，當歸補血活血，延胡索行氣止痛，合為佐藥；桃仁活血化瘀，大黃瀉火解毒與檳榔行氣利水共為使藥。 此方能改善機體運化水濕的功能，緩解UC 大鼠腹瀉癥狀， 反證其通過上調(diào)UC 大鼠結腸組織中AQPs 的表達而達到治療作用。 研究亦提示了AQPs 在UC 發(fā)病中的作用， 其對結腸水液代謝的影響是UC 發(fā)病的作用機制之一。

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