王學(xué)良，盧秉久

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽110032）

軟肝沖劑對四氯化碳所致小鼠肝纖維化模型的影響

王學(xué)良，盧秉久*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽110032）

目的 觀察軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維化小鼠模型的治療作用。方法 取50只雄性SPF級C57B／L小鼠，隨機(jī)分為空白對照組、模型組和軟肝沖劑治療組。給予空白對照組100%花生油1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型組給予含20%四氯化碳的花生油1 mL／kg腹腔注射，2次／周，共10周；軟肝沖劑3個治療組第3周起給予軟肝沖劑高、中、低7.5、5.0、3.5 g／（kg?d）劑量灌胃至第10周。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測小鼠血清中的透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、三型前膠原（PCⅢ）、四型膠原（Ⅳ-C）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量；計算肝臟指數(shù)；使用Masson和HE染色觀察肝臟的病理組織學(xué)改變。結(jié)果 軟肝沖劑組血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組和高劑量組肝臟指數(shù)與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)軟肝沖劑中、高劑量組小鼠肝臟的炎性浸潤和脂肪空泡消失，Masson染色顯示在匯管區(qū)無纖維素沉積。結(jié)論 軟肝沖劑可以降低四氯化碳所致小鼠肝纖維化模型中血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的水平，對肝臟具有保護(hù)作用。

軟肝沖劑；四氯化碳；肝纖維化

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展到一定階段的共同特征，從病理學(xué)角度上看，肝纖維化是肝細(xì)胞基質(zhì)代謝異常，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的合成增多而分解減少，最終導(dǎo)致其大量沉積的過程［1-5］。近年來，隨著肝纖維化無創(chuàng)診斷的普及推廣，其檢出率明顯升高，因此抗肝纖維化治療成為新一輪的研究熱點(diǎn)［6］。目前西醫(yī)治療肝纖維化尚無特效方法，在代償期主要以護(hù)理為主；失代償期主要采用支持療法以控制疾病發(fā)展速度?？垢卫w維化的西藥如秋水仙堿、青霉胺等，在動物實(shí)驗(yàn)中可從一定程度上改善肝纖維化的癥狀，但在臨床應(yīng)用中療效并不十分理想，而且毒副作用大。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥，尤其是中藥復(fù)方具有多成分、作用于多個靶點(diǎn)，可以通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多層次發(fā)揮治療作用的特點(diǎn)，因此尋找和進(jìn)一步發(fā)掘中藥抗肝纖維化的藥物及其效應(yīng)機(jī)制被認(rèn)為是抗肝纖維化的有效途徑［7-8］。如姜輝等［9］就通過實(shí)驗(yàn)研究證明三七總皂苷對肝纖維化大鼠肝臟具有明顯保護(hù)作用。本文旨在通過探討中藥復(fù)方軟肝沖劑對四氯化碳性所致肝纖維小鼠模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要儀器 實(shí)驗(yàn)動物C57B／L小鼠50只，體質(zhì)量（20±1）g，4～5周齡，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，全自動生化檢測儀，721可見光分光光度計。

1.2 藥物 水合氯醛及四氯化碳（CCl4分析純）均從北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司購入；魯花牌花生油購于超市；HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C試劑盒購自上海研晶生物科技有限公司；ALT和AST堅持試劑購于上海科華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；軟肝沖劑由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心煎制。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和動物模型制備 取SPF級C57B／L雄性小鼠隨機(jī)為空白對照組、模型組和軟肝沖劑治療組，其中正常組、模型組每組各10只，軟肝沖劑治療組30只，并按照給藥劑量不同分為軟肝沖劑低劑量組、中劑量組和高劑量組 ，按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［10］中方法換算成大鼠給藥量劑量分別為 3.5、5.0、7.5 g／（kg?d），每組10只。空白對照組100%花生油按照1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型組給予含20%四氯化碳的花生油1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周；軟肝沖劑組給予含20%四氯化碳的花生油1 mL／kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起至第10周，給予軟肝沖劑（劑量按人體-大鼠體表面積比值換算）灌胃高、中、低劑量組分別為7.5、5.0、3.5 g／（kg?d），空白對照組和模型組在同期內(nèi)給予生理鹽水灌胃。

1.4 組織采樣 在小鼠處死前，通過摘取眼球取血，經(jīng)離心后將血清用全自動生化分析儀分析HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST各項(xiàng)指標(biāo)；摘取肝臟稱重，計算肝臟指數(shù)，并留取部分肝臟組織浸泡在5%的福爾馬林溶液中固定，做Masson和HE染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠肝臟指數(shù)的影響 見表1。

表1 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠肝臟指數(shù)的影響（±s，n＝10）

表1 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠肝臟指數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較 ，＃P＜0．05；與模型組比較 ，△P＜0．05

／%空白對照組 — 3．0±0．8模型組 — 4．8±1.1＃軟肝沖劑低劑量組 3．5 4．7±0．9＃軟肝沖劑中劑量組 5．0 3．8±0．5△軟肝沖劑高劑量組 7．5 3．5±0．4組 別 給藥劑量／（g／kg） 肝臟指數(shù)△

2.2 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠肝功能指標(biāo)的影響 見表2，表3。通過HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C試劑盒檢測其在血清中的含量；通過全自動血液生化分析儀檢測ALT和AST在血清中的含量。

表2 軟干沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠血清中ALT和AST的影響（±s，n＝10） U／L

表2 軟干沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠血清中ALT和AST的影響（±s，n＝10） U／L

注：與空白對照組比較 ，＃P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

AST空白對照組 33．7±4．5 41．7±6．5模型組 140．4±9．8＃ 198.2±9．7＃軟肝沖劑低劑量組 115．4±7．6＃ 182．5±6.3＃軟肝沖劑中劑量組 104．4±8.2?！?155．6±11.2＃軟肝沖劑高劑量組 102.1±6．5?！?133.1±10.1組 別 ALT?！?/p>

表3 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響（±s，n＝10） μg／L

表3 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響（±s，n＝10） μg／L

注：與空白對照組比較 ，＃P＜0.05；與模型組相比較 ，△P＜0.05

組 別 HA LN PCⅢ Ⅳ-C空白對照組 110．22±21．31 119．26±23．21 140．23±40．66 94．23±18．34模型組 500．11±82．12＃ 421．65±50．43＃ 487．34±40．21＃ 300．11±40．21＃軟肝沖劑低劑量組 321．45±44．21?！?300．02±43．89?！?340．64±30．20＃ 199．22±31．12＃軟肝沖劑中劑量組 220．54±20．65△ 263．11±54．24△ 243．41±47．32△ 140．33±32．21△軟肝沖劑高劑量組 132．71±32．11△ 141．65±30．67△ 160．32±31．26△ 104．23±21．01△

2.3 軟肝沖劑對四氯化碳性肝纖維小鼠肝臟病理變化的影響 空白對照組中的小鼠肝細(xì)胞邊界清晰，胞膜完整，細(xì)胞核核膜完整，胞漿染色均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，無炎細(xì)胞浸潤，Masson染色顯示在中央靜脈和門管區(qū)無纖維增生；模型組中的小鼠肝細(xì)胞不完整、形態(tài)大小不均一，肝細(xì)胞脂肪變性清晰可見，有假小葉的形成，同時伴有炎性浸潤，Masson染色顯示在中央靜脈和門管區(qū)有纖維增生；軟肝沖劑低劑量組中，病理改變與模型組相似；軟肝沖劑高劑量組中，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見脂肪變與假小葉形成，Masson染色無纖維沉積。

3 討論

軟肝沖劑是在中醫(yī)“標(biāo)本兼治”基本思想的指導(dǎo)下，繼承已故全國名老中醫(yī)、肝病專家王文彥教授肝硬化、肝纖維化發(fā)病的中心環(huán)節(jié)為“脾虛肝郁”，其他血瘀、水停皆由此產(chǎn)生的學(xué)術(shù)思想，由經(jīng)驗(yàn)方軟肝煎運(yùn)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成。方中柴胡配白術(shù)以疏肝解郁、健脾益氣，2藥共為君藥，乃方之根基；以延胡索、木香、荔枝核行氣活血止痛，郁金、丹參活血化瘀，4藥共為臣，以治氣滯血瘀之標(biāo)，柴胡、郁金、丹參3藥被盧秉久教授譽(yù)為“肝病三劍客”［11］；佐以莪術(shù)、鱉甲、水紅花子、蓼實(shí)以活血消癥化積、軟堅散結(jié)；澤蘭善于利水，兼有活血之功，可防瘀血、水濁互結(jié)腹中而成鼓脹。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典四氯化碳作為誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生肝纖維化和肝硬化的肝毒物［12］。其檢測指標(biāo)LN是細(xì)胞外間質(zhì)中非膠糖蛋白的成分，當(dāng)肝臟發(fā)生慢性炎癥損傷時肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞均參與合成LN，并在肝竇內(nèi)大量累積［13］；HA是一種糖胺多糖，由間質(zhì)細(xì)胞合成、分泌，肝臟受損時由于合成增多，肝臟代謝能力下降，血清HA水平增高，其也是反映肝纖維化最具價值的血清學(xué)標(biāo)志物［14］，故血清中HA、LN水平可真實(shí)反映肝臟炎癥程度，并與肝纖維化程度密切相關(guān)［15］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)軟肝沖劑可以明顯改善四氯化碳性肝纖維化模型小鼠血清中肝纖維化、肝功能指標(biāo)，并使小鼠肝臟的炎性浸潤和脂肪空泡消失、匯管區(qū)無纖維素沉積，具有明顯的保肝作用。

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Ruan Gan Granule in mice caused by carbon tetrachloride liver fibrosis model

WANG Xueliang，LU Bingjiu*
（Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang 110032，China）

Objective To observe the therapeutic effect of Ruangan Granule on CCl4induced liver fibrosis model in mice．Methods The 50 male SPF C57B／L mice，which were rando mLy divided into control group，model group and treatment group，Ruangan granule．Give control group 100%1 mL／kg intraperitoneal injection of peanutoil，2 times a week，a total of 10 weeks；model group were fed with 20% carbon tetrachloride peanut oil by intraperitoneal injection of 1 mL／kg，2 times a week，a total of 10 weeks of treatment；Ruangan Granule group third weeks for Ruangan Granule（dose in rats according to the human body surface area ratio conversion：high dose group 7．5 g／（kg?d）middle dose group；5 g／（kg?d）；low dose group 3．5 g／（kg?d）by gavage to tenth weeks．At the end of the experiment，detection of hyaluronic acid in serum（HA），laminin（LN），procollagen type three（PCⅢ），type four collagen（Ⅳ-C），alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）levels to calculate the liver index；staining；the liver histopathological changes using Masson and HE．Results The content of Ruangan Granule group in serum HA，LN，PCⅢ，IV-C，ALT and AST were lower than the model group，the difference was statistically significant（P＜0．05）；middle dose group and high dose group liver index compared with the model group has statistical significance（P＜0．05）；pathological examination revealed that inflammatory soft liver granule medium dose and high dose group mice liver and fat vacuoles disappeared，Masson staining showed no fibrindeposition in the portal area．Conclusion Ruangan Granule can reduce the hepatic fibrosis model induced by CCl4in mice serum HA，LN，PCⅢ，Ⅳ-C，ALT and AST level，has a protective effect on liver．

Ruangan Granule；liver fibrosis；carbon tetrachloride

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0911-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．010

2015-03-17）

遼寧省自然科學(xué)基金計劃項(xiàng)目（201102142）；社會發(fā)展公關(guān)計劃項(xiàng)目（2012225018）。

王學(xué)良（1981-），男 ，碩士研究生 ，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)肝病方向研究。

*通信作者：盧秉久，電話-18102457027，電子信箱-lubingjiu＠163．com