王 妍，林孝發(fā)，張微微，韋 康，王中漢，田建明*

（1．深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518044；2．吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130021；

3．吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院，長春130041）

重組人干擾素β-1a注射液對大鼠肝纖維化模型的治療作用

王 妍1，林孝發(fā)1，張微微2，韋 康2，王中漢3，田建明2*

（1．深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518044；2．吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130021；

3．吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院，長春130041）

目的 研究重組人干擾素β-1a注射液及白蛋白注射液對肝纖維化大鼠的治療作用。方法 通過給大鼠灌服50%的四氯化碳花生油溶液1 mL／kg，每周2～3次，5周后開始使用受試藥物（隔日注射1次），同時(shí)繼續(xù)同上灌服50%的四氯化碳花生油溶液。9周后取血、取肝臟，測定血清ALT、AST、TP、ALB、TBIL，測定肝組織羥脯氨酸含量，并對肝臟做病理組織學(xué)檢查。結(jié)果 干擾素β-1a、白蛋白注射液均能明顯降低肝纖維化模型大鼠血清的ALT、AST、TBIL，能明顯升高肝纖維化大鼠血清ALB、ALB／GLB，且能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸含量。結(jié)論 干擾素β-1a、白蛋白注射液對肝纖維化模型大鼠的肝纖維化程度均有明顯的抑制作用。

重組人干擾素β-1a注射液；白蛋白注射液；大鼠肝纖維化模型

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，如病毒性肝炎，酒精性肝炎及一些自身免疫疾病都可發(fā)展導(dǎo)致肝纖維化［1］。目前臨床對于肝纖維化的治療主要是針對原發(fā)疾病的處理以及一些護(hù)肝、抑制炎性增生的治療措施，而具體對于抗纖維化的治療仍是缺乏的。在80年代早期，Tacobs最早開始人干擾素方面的研究，至今已取得了飛躍性的發(fā)展。現(xiàn)在β-la和β-1b干擾素（IFN）均已在全世界范圍內(nèi)用于多發(fā)性硬化（MS）復(fù)發(fā)及緩解期的治療，并取得了滿意的療效［2-4］。本項(xiàng)目組曾報(bào)道［5］重組人干擾素β-1a對BALB／C小鼠硬化癥的療效評(píng)價(jià)，證實(shí)重組人干擾素β-1a對小鼠硬化癥模型有明顯的改善作用，本文繼續(xù)就本院自主研發(fā)的重組人干擾素β-1a及白蛋白注射液在治療大鼠肝纖維化的機(jī)制方面做進(jìn)一步的探討。報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠80只，雄性，體質(zhì)量100～120 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001。

1.2 受試藥物 重組人干擾素β-1a注射液（簡稱β-1a），濃度0.22 mg／mL，活性3.2×106IU／mL，批號(hào)20140701，深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供；白蛋白注射液，濃度0.17 g／mL，批號(hào)20140801，深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供；利比（進(jìn)口重組人干擾素β-1a注射液），規(guī)格：22 μg／0.5 mL，產(chǎn)品批號(hào)：BA003059，由默克雪蘭諾公司意大利藥廠提供。

1.3 試劑 苯巴比妥，分析純，含量≥99% ，天津化學(xué)試劑三廠，生產(chǎn)批號(hào)：20140518；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒，深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)140114032；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)140214024；總膽紅素（TBIL）試劑盒，深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)140215004；總蛋白（TP）試劑盒，深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)140813021；白蛋白（ALB）試劑盒，深圳邁瑞醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)140914018；羥脯氨酸測定試劑盒：由南京建成生物工程研究所提供；規(guī)格：50T／48樣，生產(chǎn)批號(hào)20141219，有效期至20150618。

1.4 儀器 迪瑞CS-600B全自動(dòng)生化分析儀；GFD800型半自動(dòng)生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 肝纖維化模型制備［6-8］取Wistar雄性大鼠80只，將造模大鼠先自由飲用35 mg／dL的苯巴比妥溶液，2周后灌胃給予50%的四氯化碳花生油溶液1.0～1.2 mL／kg體質(zhì)量，每周2～3次，共9周。

2.2 分組 在灌胃給予50%的四氯化碳造模的第5周，將造模大鼠分成5組：模型組、陽性藥利比組、白蛋白注射液組、β-1a干擾素低、高劑量組，另一組為正常對照組。

2.3 劑量設(shè)計(jì) 陽性對照藥利比，22 μg／0.5 mL，臨床用量1～4周內(nèi)22 μg／人，即0.314 3 μg／kg（人均體質(zhì)量按70 kg計(jì)），折算成大鼠的劑量為2.05 μg／kg（5.6×105IU／kg）；β-1a大鼠的低、高劑量分別為5.6、11.2×105IU／kg；陽性對照藥白蛋白注射液，濃度為0.17 mg／mL，按1 mL／kg的容積給藥，劑量為0.17 mg／kg。2.4 給藥途徑及頻次 途徑：造模的第5周開始，各組按上述劑量分別注射各受試藥物（干擾素β-1a皮下注射、白蛋白腹腔注射、利比皮下注射），隔日1次，共計(jì)給藥5周。給予受試藥期間仍然繼續(xù)按前述劑量灌胃給予50%的四氯化碳，直到試驗(yàn)結(jié)束。

2.5 取材 末次給藥后24 h，6%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r／min離心5 min，取血清備用；取肝組織稱重；取肝組織約80 mg備用；再取肝組織（一個(gè)肝葉），置10%福爾馬林溶液中固定備用。

2.6 檢測指標(biāo)

2.6.1 血清生化指標(biāo) 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）。

2.6.2 肝組織羥脯氨酸含量 方法：取80 mg左右的肝組織，按照羥脯氨酸試劑盒說明書Ⅵ（樣本減水解法）進(jìn)行操作及計(jì)算含量。

2.6.3 病理組織學(xué)檢查 取肝用10%的福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，照相。

3 結(jié)果

3.1 對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝臟臟體系數(shù)的影響見表1。

表1 干擾素β-1a、白蛋白對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝臟臟體系數(shù)的影響（±s）

表1 干擾素β-1a、白蛋白對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝臟臟體系數(shù)的影響（±s）

注：與正常組比較 ，＃＃＃P＜0．001；與模型組比較 ，△P＜0.05

臟體系數(shù)正常對照組 12 574．9±41．46 13．57±1．02 2．37±0．17模型組 14 439．6±43．97＃＃＃ 14．91±2．93 3．38±0．53＃＃＃β-1a 5．6×105IU／kg組 13 459．0±34．93 15．33±1．81 3．35±0．43 β-1a 11.2×105IU／kg組 12 490．4±47．03△ 15．58±2．25 3．19±0．47白蛋白0．17 mg／kg組 13 463．0±42．92 13．39±2．68 2．99±0．42△利比5．6×105IU／kg組 11 459．5±31．16 14．35±2．15 3．12±0．39組 別 n 體質(zhì)量／g 肝臟重／g

3.2 對肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)的影響見表2。

表2 干擾素β-1a對肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

表2 干擾素β-1a對肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0．001；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0．01，△△△P＜0．001

GLB正常對照組 12 76．15±18．70 99．39±12．77 5．31±0．43 55．93±4．03 33．53±1．50 1．81±0．43模型組 14 208．06±103．81＃＃＃186．21±87．18＃＃ 7．26±1．53＃＃＃ 55．94±6．15 31．71±2．70＃＃＃ 1．36±0．28＃＃β-1a 5．6×105IU／kg組 13 133．92±36．45△129．32±35．10△ 6．10±0．89△ 56．24±3．66 33．95±1．25△ 1．54±0．15△β-1a 11.2×105IU／kg組 12 109．89±37．00△△104．41±30．94△△ 5．37±0．59△△△ 55．08±3．93 33．79±1．68△ 1．60±0．16△白蛋白0．17 mg／kg組 13 113．72±60．51△△105．95±55．46△△ 5．62±1．38△△ 55．85±3．84 33．77±2．12△ 1．55±0．19△利比5．6×105IU／kg組 11 102．81±35．57△△112．90±32．44△△ 5．86±0．36△△ 54．72±3．89 33．74±1．35△ 1．63±0．21組 別 n ALT／（U／L） AST／（U／L） TBIL／（μmol／L） TG／（g／L） ALB／（g／L） ALB／△

3.3 對肝組織羥脯氨酸含量的影響 見表3。

3.4 病理組織學(xué)檢查 病理形態(tài)觀察結(jié)果判定。纖維化程度分期［9］：0期，無纖維化；1期，匯管區(qū)擴(kuò)大，輕度纖維化；2期，匯管區(qū)周圍纖維化，纖維隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；3期，纖維隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；4期，早期肝硬化。光鏡下閱片，觀察組織病理學(xué)改變，對評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果，正常組12只全部為0期；模型組有2只為3期、12只為4期；β-1a干擾素5.6×105IU／kg組有4只為2期、3只為3期、6只為4期；β-1a干擾素11.2×105IU／kg組有1只為2期、3只為2期、4只為3期、4只為4期；白蛋白組有1只為2期、7只為3期、5只為4期；利比組有3只為2期、3只為3期、5只為4期。

表3 干擾素β-1a對肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸含量的影響（±s） μg／mg

表3 干擾素β-1a對肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸含量的影響（±s） μg／mg

注：與正常組比較 ，＃＃＃P＜0．001；與模型組比較 ，△P＜0.05

羥脯氨酸含量正常對照組 12 0．259±0．052模型組 14 0．514±0．096＃＃＃β-1a 5．6×105IU／kg組 13 0．434±0．081△β-1a 11.2×105IU／kg組 12 0．410±0．104△白蛋白0．17 mg／kg組 13 0．395±0．125△利比5．6×105IU／kg組 11 0．425±0．087組 別 n△

4 討論

正常時(shí)肝的纖維組織形成和降解保持動(dòng)態(tài)的平衡。如果在各種致病因子的作用下，纖維組織形成增多而降解減少則可導(dǎo)致肝纖維化［10-11］。本試驗(yàn)動(dòng)物肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)表明，大鼠口服CCl4可造成肝纖維化及早期肝硬化，注射受試藥物β-1a干擾素、利比及白蛋白進(jìn)行干預(yù)治療后，肝纖維化程度均有不同程度的明顯減輕。

肝纖維化后，肝細(xì)胞受損，肝臟合成蛋白質(zhì)水平下降，導(dǎo)致器官發(fā)育受阻，導(dǎo)致體質(zhì)量減輕，而由于肝纖維化時(shí)肝臟內(nèi)成纖維細(xì)胞分泌大量膠原纖維，可致肝臟重量增加［12］。表1所示，經(jīng)受試藥干預(yù)后，體質(zhì)量下降、臟體系數(shù)升高均有一定改善，其中β-1a高劑量組體質(zhì)量明顯高于模型組，白蛋白組肝臟臟體系數(shù)明顯低于模型組。

肝臟是體內(nèi)多種生化反應(yīng)的主要場所，當(dāng)其受到損傷引發(fā)病理性病變時(shí)，可引起ALT、AST、TBIL、TG等血清學(xué)指標(biāo)的變化［13］。表2所示，經(jīng)受試藥干預(yù)后ALT、AST、TBIL與模型組比較明顯下降，ALB、ALB／GLB與模型組比較明顯升高。

由于羥脯氨酸為膠原纖維所特有，故測定組織羥脯氨酸的含量，可間接換算出膠原蛋白的含量，以判斷肝纖維化程度［14］，據(jù)此也可以判斷治療效果。表3所示，各受試藥物均能明顯降低肝硬化小鼠肝內(nèi)羥脯氨酸的含量，降低膠原蛋白的含量，使肝組織膠原纖維化程度明顯減輕。由于蛋白質(zhì)類藥物具有高活性、特異性強(qiáng)、低毒等特點(diǎn)，所以近年來治療肝纖維化的蛋白質(zhì)藥物有了很大發(fā)展，但很多該類藥物還停留在實(shí)驗(yàn)研究階段［15］。

本研究證實(shí)，干擾素β-1a、白蛋白注射液能抑制肝纖維化大鼠肝內(nèi)成纖維細(xì)胞合成膠原纖維的功能 ，使肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)積聚減少，有效延緩肝纖維化進(jìn)程，改善肝功能。本研究對肝纖維化從宏觀水平深入到細(xì)胞、分子水平進(jìn)行了研究，闡述了干擾素β-1a、白蛋白注射液預(yù)防性治療大鼠肝纖維化的效果和機(jī)理 ，證實(shí)干擾素β-1a、白蛋白注射液能有效地治療四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化，具有廣闊的開發(fā)前景。

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Therapeutical effect of human-interferon recombineβ-1a injection on model of rats with hepatic fibrosis

WANG Yan1，LIN Xiaofa1，ZHANG Weiwei2，WEI Kang2，WANG Zhonghan3，TIAN Jianming2*
（1．Shenhzen Polytechnic，Shenzhen 518044，China；2．Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130021，China；3．The Second Clinical Medical College of Jilin University，Changchun 130041，China）

Objective To analyze the therapeutical effect of human-interferon recombineβ-1a injectio and the albumin injectio on the rats hepatic fibrosis．Methods Feed rats with 50%solutions of CCl peanut oil 1 mL／kg，2-3 times／week，use the testing drugs after 5 weeks（alternates day per times），and at the same time continuously feed the rats with 50%solutions of CCl peanut oil．Sample the blood and liver after 9 weeks and measure ALT，AST，TP，ALB，TBIL of the blood plasma and the Hyp of the liver tissue，and undertake the histopathology of the liver tissue．Results Human-interferon recombine β-1a injectio and the albumin injectiocan obviously decrease the ALT，AST，TBIL of blood plasma of the model of the hepatic fibrosis rats evidently，and increase Hyp of the liver tissue of the model of the hepatic fibrosis rats at the meantime．Conclusi on Human-interferon recombineβ-1a injectio and the albumin injectio can inhibit the level of the hepatic fibrosis of the model rats．

human-interferon recombineβ-1a injection；albumin injectio；model of rats with hepatic fibrosis

R963

A

2095-6258（2015）05-0904-04

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．008

2015-05-05）

廣東省教育廳項(xiàng)目（2012B091100408）；深圳市科技創(chuàng)新委項(xiàng)目（CXZZ20120619162250509）。

王 妍（1962-），女，博士，研究員，主要從事分子生物學(xué)研究。

*通信作者：田建明，女，碩士，主任藥師，電話-13500806753，電子信箱-tianjm62＠sina．com