王 權(quán)，王心雪，毛 穎，康勁松，孫連坤，李洪巖

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，長春130021）

?實(shí)驗(yàn)研究?

鹿骨粉對去卵巢大鼠心臟組織抗氧化因子 Sirt-3、SOD-2、HO-1和NQO-1表達(dá)的影響

王 權(quán)，王心雪，毛 穎，康勁松，孫連坤，李洪巖*

（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，長春130021）

目的 探討鹿骨粉對去卵巢大鼠心肌組織中抗氧化因子Sirt-3、SOD-2、HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)以及心臟抗氧化能力的影響。方法 將Wistar大鼠兩側(cè)卵巢摘除后，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（Model）組、鹿骨粉（SBP 200、400、800 mg／kg）劑量組。術(shù)后即刻給予鹿骨粉治療16周后處死大鼠，取出心臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測Sirt-3、SOD-2、HO-1、NQO-1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與Model組比較，SBP各組心肌組織中Sirt-3、SOD-2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)均成增多趨勢。結(jié)論 鹿骨粉能夠促進(jìn)去卵巢大鼠心肌細(xì)胞中Sirt-3、SOD-2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)，提高心臟的抗氧化能力。

鹿骨粉；去卵巢大鼠；更年期綜合征；心肌衰老；抗氧化因子

女性絕經(jīng)后的更年期綜合征對全身多系統(tǒng)都有影響，伴隨著多種疾病的發(fā)生，其中危害最嚴(yán)重的屬心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，包括心肌梗死、心肌病和心力衰竭等。這些心臟疾病的發(fā)生可歸因于女性絕經(jīng)后心肌逐漸發(fā)生衰老的現(xiàn)象。在此時(shí)，心肌細(xì)胞中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的各個(gè)系統(tǒng)均發(fā)生著變化，心肌細(xì)胞的多種清除功能逐漸降低，其中抗氧化能力不足導(dǎo)致ROS的蓄積是心肌衰老的重要因素［1-3］。研究［4-5］表明，提高心肌抗氧化能力能夠?qū)顾ダ系陌l(fā)生。Sirt-3和Nrf-2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)在清除ROS方面發(fā)揮著重要作用［1，6-8］。鹿骨粉作為傳統(tǒng)中藥材 ，在抗氧化、抗衰老方面有著獨(dú)特的作用。本課題組通過去卵巢大鼠模型來模擬女性絕經(jīng)后更年期綜合征，觀察了鹿骨粉對心肌抗氧化因子Sirt-3、SOD-2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)的影響，評估其對抗氧化能力的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雌性大鼠110只，體質(zhì)量200～220 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號SCXK-（吉）2008-0005。大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，食物和水隨意喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度控制在（25±1.4）℃，光線控制模擬白天12 h、黑夜12 h的晝夜交替。

1.2 卵巢摘除模型的建立 腹腔注射10%水合氯醛麻醉劑3 mL／kg，大鼠仰臥固定。于臍與恥骨前緣中點(diǎn)沿腹底壁正中線向上側(cè)后方切開皮膚2.5～3 cm，依次切開腹白線、腹膜、腹腔，暴露腹內(nèi)臟器。沿切口下方找到子宮體與一側(cè)子宮角，沿子宮角向前探索到卵巢，用4號絲線結(jié)扎卵巢系膜血管后切除卵巢，用同樣方法切除另一側(cè)卵巢。將臟器依次還納入腹腔后縫合腹膜、腹壁皮膚，并用碘酒消毒。于術(shù)后肌注青霉素45萬U／只。

1.3 大鼠心臟免疫組織化學(xué)染色 將大鼠心臟分離后用4%多聚甲醛溶液灌流沖洗干凈后固定24 h。經(jīng)脫水、透明處理后進(jìn)行石蠟包埋，切片、脫蠟、水化處理。用 3%H2O2去離子水孵育 10 min，后于0.01 mol／L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸 15～20 min。冷卻至室溫后滴加正常山羊血清封閉20 min，加相應(yīng)抗體4℃過夜。次日，常規(guī)DAB顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染2 min，經(jīng)脫水封片。在顯微鏡（Olympus BX51，Japan）下，在20×視野下觀察免疫組織化學(xué)染色切片，觀察每組5張切片的5個(gè)隨機(jī)視野評估相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)是用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對多個(gè)樣本進(jìn)行單因素方差分析和Student'st test進(jìn)行組間比較。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鹿骨粉能夠促進(jìn)卵巢摘除大鼠心臟組織Sirt-3表達(dá) 鏡下觀察切片，每組3張切片，每張切片取10個(gè)視野觀察分析。與Sham組比較，Model組心肌細(xì)胞Sirt-3表達(dá)減少（P＜0.05）。SBP 400和SBP 800 2組心肌細(xì)胞Sirt-3表達(dá)呈不同程度的增多，SBP 800組增多的最為明顯（P＜0.05）。

2.2 鹿骨粉能夠促進(jìn)卵巢摘除大鼠心臟組織SOD-2表達(dá) 鏡下觀察切片，每組3張切片，每張切片取10個(gè)視野觀察分析。Model組心肌細(xì)胞SOD-2表達(dá)與Sham組比較有所降低（P＜0.05）。SBP 200組與Sham組比較增高不明顯（P＞0.05）。SBP 400和SBP 800 2組心肌細(xì)胞SOD-2表達(dá)增多，且SBP 800組增多最為明顯（P＜0.05）。

2.3 鹿骨粉能夠促進(jìn)卵巢摘除大鼠心臟組織HO-1表達(dá) 鏡下觀察切片，每組3張切片，每張切片取10個(gè)視野觀察分析。相對于Sham組，Model組心肌細(xì)胞HO-1表達(dá)降低（P＜0.05）。SBP 200組與Sham組比較，HO-1表達(dá)量基本相同（P＞0.05）。SBP 400和SBP 800 2組心肌細(xì)胞HO-1表達(dá)增多，其中SBP 800組增多最為明顯（P＜0.05）。

2.4 鹿骨粉能夠促進(jìn)卵巢摘除大鼠心臟組織NQO-1表達(dá) 鏡下觀察切片，每組3張切片，每張切片取10個(gè)視野觀察分析。與Sham組相比較，Model組心肌細(xì)胞NQO-1表達(dá)略有降低（P＜0.05）。SBP 200組與Sham組比較，NQO-1表達(dá)量差距不明顯（P＞0.05）。SBP 400和SBP 800 2組心肌細(xì)胞NQO-1表達(dá)略有增多（P＜0.05）。

2.5 Sirt-3、SOD-2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)陽性率鏡下觀察切片，每組3張切片，每張切片取10個(gè)視野觀察分析。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)表達(dá)目的蛋白的心肌細(xì)胞數(shù)量，采用灰度值分析統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)含量。采用“＋”表示蛋白表達(dá)情況?！埃北硎镜鞍讖?qiáng)陽性表達(dá)，“＋＋”表示蛋白陽性表達(dá)，“＋”表示蛋白弱陽性表達(dá)。見表1。

表1 各組蛋白表達(dá)陽性率統(tǒng)計(jì)分析（±s）

表1 各組蛋白表達(dá)陽性率統(tǒng)計(jì)分析（±s）

組 別 Sirt-3 SOD-2 HO-1 NQO-1假手術(shù)組 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋模型組 ＋ ＋ ＋ ＋SBP 200mg／kg組 ＋ ＋ ＋ ＋＋SBP 400mg／kg組 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋SBP 800mg／kg組 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋

3 討論

Nrf-2及其下游抗氧化元件AREs是機(jī)體最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路［1，6］。生理情況下，Nrf-2與其抑制因子Keap-1處于結(jié)合狀態(tài)，當(dāng)有氧化應(yīng)激因子刺激時(shí)，如O2-、H2O2、HO2?、?OH等ROS家族因子，Nrf-2與Keap-1分離進(jìn)入細(xì)胞核，與AREs抗氧化元件識別結(jié)合，啟動(dòng)下游Ⅱ相解毒酶等保護(hù)因子的轉(zhuǎn)錄、翻譯，提高細(xì)胞的抗氧化能力。血紅素加壓素-1（HO-1）與醌氧化還原酶-1（NQO-1）是AREs抗氧化元件中最重要的抗氧化因子［1，9-10］。有研究［10-12］表明 ，H2O2能夠引起HO-1與NQO-1表達(dá)增高，同時(shí)，促進(jìn)HO-1與NQO-1表達(dá)增高也能夠清除O2-、H2O2、HO2?等ROS因子，減輕心肌細(xì)胞損傷，提高對心肌梗死、心肌缺血再灌注和心力衰竭的耐受性。在研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠兩側(cè)卵巢摘除后在心肌組織中 HO-1和NQO-1的含量明顯減少。在鹿骨粉治療后能夠明顯提高心肌的抗氧化能力，促進(jìn)HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)增高，對抗ROS引起的心肌細(xì)胞損傷。

Sirt-3屬于Sirtuins家族成員，是一類依賴NAD＋的組蛋白去乙?；?，參與器官的代謝活性。Sirt-3分布于高代謝活性的器官，如肝臟、心臟、腎臟等。研究［7，13］發(fā)現(xiàn)，Sirt-3參與著多種信號途徑 ，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、能量代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)等。近些年來，對于Sirt-3與心臟疾病的研究越來越多，尤其是其抗氧化能力與心肌衰老更為關(guān)注［13-15］。研究［16］發(fā)現(xiàn)，Sirt-3能夠通過促進(jìn)SOD-2表達(dá)增高來增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。在卵巢摘除大鼠的心肌組織中，Sirt-3和SOD-2的表達(dá)明顯降低，而鹿骨粉能夠促進(jìn)二者表達(dá)增高，增強(qiáng)心肌的抗氧化能力，延緩心肌因抗氧化能力不足而引起的心肌衰老過程。

綜上所述，通過去卵巢大鼠模型模擬女性絕經(jīng)后更年期綜合征，探究對其心臟抗氧化反應(yīng)的影響。結(jié)果可以看出，心肌組織中抗氧化能力明顯降低，Sirt-3、SOD-2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)均有不同程度的降低。鹿骨粉含有大量的膠原蛋白和彈性蛋白成分，能夠促進(jìn)Sirt-3、SOD-2、HO-1和NQO-1表達(dá)增高，提高心肌抗氧化能力，對抗心肌衰老，具有保護(hù)心肌的作用。然而，鹿骨粉對于心臟的保護(hù)作用仍需更多的研究來證明。

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Sika Bone Power on expression of antioxidative factors of Sirt-3，SOD-2，HO-1 and NQO-1protein in rat heart issue after ovariectomization

WANG Quan，WANG Xinxue，MAO Ying，KANG Jinsong，SUN Lainkun，LI Hongyan*
（Department of Pathophysiology，Basic Medical College of Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To discuss the effects of sika bone power on the expression of antioxidative factors of Sirt-3，SOD-2，HO-1 and NQO-1 protein in rat heart issue after ovariectomization．Methods After the wistar rats are received the ovariectomy，the ovariectomized rats are randomly divided into five groups：Sham group，Model group，and three sika bone power groups（SBP200 mg／kg，SBP400 mg／kg，and SBP 800 mg／kg）．They are given immediate medication for 4 months after ovariectomy，hearts are taken out to conduct chemical staining of immunologic tissues，and then we utilize Western Blot to detects expression Sirt-3，SOD-2 HO-1 and NQO-1 protein in heart issue．Results Compared with model group，the expression of Sirt-3，SOD-2 HO-1 and NQO-1 protein shows an increasing tendency in SBP groups．Conclusion The sika bone power could up-regulate the expression of Sirt-3，SOD-2 HO-1 and NQO-1 protein，and improve the antioxidant ability of the heart．

sika bone power；ovariectomized rat；climacteric syndrome；myocardial ageing；antioxidative factor

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0890-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．004

2015-05-13）

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“至納米級鹿骨粉開發(fā)及其生物相容性和生物效能的研究”（20120913）。

王 權(quán)（1986-），男，碩士，主要從事腎臟物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的研究。

*通信作者：李洪巖，電話-13756551653，電子信箱-hongyan＠jlu．edu．cn