許鵬唐 鄭雅 陸陽(yáng) 周廣東 劉偉 曹誼林 張文杰

骨髓單個(gè)核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠皮瓣存活率的比較

許鵬唐 鄭雅 陸陽(yáng) 周廣東 劉偉 曹誼林 張文杰

目的比較來(lái)源于等量骨髓的單個(gè)核細(xì)胞與經(jīng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)大鼠隨意皮瓣成活率的效果。方法取等質(zhì)等量的大鼠骨髓，一半直接離心獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，一半經(jīng)體外培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，注射相等數(shù)量（n=6）的大鼠隨意皮瓣。術(shù)后測(cè)量并計(jì)算皮瓣成活面積，取材，行組織學(xué)檢測(cè)，計(jì)數(shù)CD31陽(yáng)性血管數(shù)量。結(jié)果未經(jīng)培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞組皮瓣的平均存活率為（71.6±8.4）%，培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組平均存活率為（66.2±3.1）%，這兩組存活率均顯著高于注射平衡液的對(duì)照組（55.9±3.4）%；注射細(xì)胞組之間平均存活率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織學(xué)血管密度計(jì)數(shù)顯示，骨髓單個(gè)核細(xì)胞組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組的微血管數(shù)量分別是（58.2±6.8）和（42.7±5.1），都顯著高于PBS對(duì)照組（22.8±3.1），而骨髓單個(gè)核細(xì)胞組也顯著高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組。結(jié)論與不經(jīng)培養(yǎng)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞相比，通過(guò)體外擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，未能顯著提高大鼠隨意皮瓣的成活率。

隨意皮瓣細(xì)胞治療骨髓單個(gè)核細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

doi∶10.3969/j.issn.1673-0364.2015.02.011

隨意皮瓣的游離端易壞死，因此在使用中其長(zhǎng)寬比例收到限制，一般為1.5∶1～2∶1。應(yīng)用交感神經(jīng)藥物、鈣通道阻滯劑、血管擴(kuò)張藥物等，可以改善皮瓣的壞死情況[1-2]，但是全身高劑量應(yīng)用這些藥物會(huì)帶來(lái)很多副作用。研究證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（b-FGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等生長(zhǎng)因子，可以改善皮瓣的壞死情況[3-5]，但應(yīng)用受到短暫半衰期的限制。

近年來(lái)，在組織再生與修復(fù)重建領(lǐng)域，干細(xì)胞的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。通過(guò)離心骨髓獲得的骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BM-MNCs）和通過(guò)體外培養(yǎng)獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），都被證明可以促進(jìn)皮瓣的成活[6-7]。理想的狀態(tài)是抽取少量的骨髓，在不丟失干細(xì)胞干性的前提下，通過(guò)體外培養(yǎng)獲得大量的BMSCs來(lái)滿足臨床應(yīng)用的需要。但是，隨著體外培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞的表型和功能都會(huì)有所改變。因此，我們比較來(lái)源于等質(zhì)等量骨髓的BM-MNCs和BMSCs對(duì)大鼠隨意皮瓣成活率的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

Wistar雄性大鼠若干，由上海西普爾-必凱公司提供，依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)指南，所有動(dòng)物都獲得人道主義對(duì)待。

胎牛血清（HyClone公司，美國(guó)）；低糖DMEM（Invitrogen公司，美國(guó)）；Ficoll液（Sigma公司，美國(guó)）；胰蛋白酶（Sigma公司，美國(guó)）；FITC或PE標(biāo)記的抗大鼠CD29、CD90、CD45抗體（BD公司，美國(guó)）；抗大鼠CD14、CD133、CD144、CD31、CD34、KDR一抗和FITC或PE標(biāo)記的相應(yīng)二抗（Abcam公司，英國(guó)）；攜辣根過(guò)氧化物酶的羊抗小鼠二抗（Abcam公司，英國(guó)）；DAB顯色劑（Dako公司，丹麥）；石蠟切片機(jī)（Thermo公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）。

1.2 BM-MNCs的分離

BM-MNCs的分離方法參照文獻(xiàn)[7]。頸椎脫臼法處死3周大的Wistar雄性大鼠，75%乙醇浸泡消毒10 min，取下雙側(cè)股骨和脛骨，剪開(kāi)長(zhǎng)骨的兩端，注射器吹出骨髓腔中的骨髓，重懸在含10%胎牛血清的低糖DMEM中。10m L骨髓重懸液加入到3m L的Ficoll液上，密度梯度離心后，分4層，抽取第2層“云霧狀”的細(xì)胞層，重懸在PBS中備用。

1.3 BMSCs的分離及培養(yǎng)

骨髓獲取方法同上。分離及培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[8]。骨髓重懸液按照1只大鼠的骨髓量接種1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，放置在含5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。2~3 d換液一次，去掉不貼壁的血液細(xì)胞，6~7 d待細(xì)胞長(zhǎng)滿90%左右傳代。之后3~4 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代至第4代，重懸于PBS中備用。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BM-MNCs和BMSCs的表型

收集新鮮分離的BM-MNCs和第4代的BMSCs，配置含4%胎牛血清的PBS緩沖液。200μL緩沖液重懸5×105個(gè)細(xì)胞，加入到EP管中并作標(biāo)記。每個(gè)EP管中分別加入1μL FITC結(jié)合的抗CD29抗體和抗CD90抗體，1μL PE結(jié)合的抗CD45抗體，1μL抗CD14、抗CD133、抗CD144、抗KDR、抗CD31、抗CD34的一抗，4℃條件下孵育30min，期間每10 min搖晃一次。孵育后，PBS緩沖液清洗3次，加入FITC或PE標(biāo)記的相應(yīng)的二抗繼續(xù)在4℃條件下孵育30min，孵育后，PBS緩沖液清洗3次。所有標(biāo)記好的樣本重懸成100μL，待上機(jī)。

1.5 隨意皮瓣模型的建立和細(xì)胞移植

選取體質(zhì)量為200~250 g的Wistar雄性大鼠，按照0.4m L/100 g的劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，備皮。手術(shù)前2 d（-2 d），把細(xì)胞懸液按7個(gè)點(diǎn)平均注射在大鼠背部皮下。手術(shù)當(dāng)天（0 d），以髂前上棘連線為蒂部在大鼠背部切取一個(gè)長(zhǎng)8 cm、寬2 cm的隨意皮瓣。切取后，用3-0的絲線原位縫合。術(shù)后第7天，測(cè)量隨意皮瓣的成活面積[9]。

為了確定有效的細(xì)胞移植劑量，新鮮分離一定數(shù)量的BM-MNCs，分別以1×106和5×106的BMMNCs注射兩組隨意皮瓣模型（n=6），同樣劑量的PBS注射作為對(duì)照組（n=6）。在術(shù)后7 d測(cè)定各組的隨意皮瓣存活面積，以此確定后期實(shí)驗(yàn)每只大鼠模型注射5×106個(gè)細(xì)胞是合適的細(xì)胞劑量。

為了比較來(lái)源于等質(zhì)等量骨髓的BM-MNCs和BNSCs的治療效果，抽取4只Wistar雄性大鼠的骨髓并平均分成兩份，一份用于直接密度梯度離心分離BM-MNCs，一份用上述的全骨髓貼壁培養(yǎng)方法獲得第4代的BMSCs。第一步：計(jì)數(shù)收集到的BMMNCs個(gè)數(shù)，按照（BM-MNCs數(shù)）/（5×106）計(jì)算出可注射大鼠的數(shù)量。第二步：計(jì)數(shù)培養(yǎng)到第4代的BMSCs個(gè)數(shù)，按照（BMSCs數(shù)/第一步計(jì)算出的可注射大鼠數(shù)量）計(jì)算出每一只大鼠接受的細(xì)胞劑量。第三步：5×106的BM-MNCs和相對(duì)應(yīng)數(shù)量的BMSCs重懸于700μL的PBS中，注射到大鼠模型的皮下，每只鼠注射7個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)注射100μL細(xì)胞懸液，每組6只鼠，對(duì)照組注射等量的PBS（n=6）。

1.6 隨意皮瓣成活率的檢測(cè)

皮瓣手術(shù)后第7天，麻醉大鼠模型，數(shù)碼相機(jī)拍攝皮瓣成活的大體情況，觀察其外觀、顏色、質(zhì)地，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析隨意皮瓣的成活面積，結(jié)果計(jì)算（成活面積/皮瓣面積×100%）。

1.7 組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后第7天，過(guò)量麻醉法處死大鼠，在隨意皮瓣長(zhǎng)軸的中部取樣，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切取6μm厚石蠟切片，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化過(guò)程，4℃孵育小鼠抗大鼠CD31抗體過(guò)夜，第二天37℃孵育攜過(guò)氧化氫酶的羊抗小鼠二抗30 min，隨后在光鏡下DAB顯色液顯色。分別在200倍光鏡下對(duì)每張石蠟切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)每張照片中的微血管數(shù)量，取平均值為樣本的微血管數(shù)量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 BM-MNCs和BMSCs的鑒定

培養(yǎng)到第4代的BMSCs呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，在體外有很強(qiáng)的增殖能力，能夠在特定條件下被誘導(dǎo)成脂、成骨、成軟骨等。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與BM-MNCs相比，BMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29和CD90，低表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物CD31和造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45（圖1、表1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物表達(dá)Fig.1 The cell surfacem arker expression p rofile of BMM NCs and BMSCs by flow cytom etry

表1 BM-MNCs和BMSCs各表面標(biāo)志物的表達(dá)情況Table 1 The cell surfacemarker expression profile of BM-MNCsand BMSCs

2.2 確定有效的細(xì)胞移植劑量

為了確定有效的細(xì)胞移植劑量，分別向隨意皮瓣模型中注射1×106或5×106新鮮分離的BMMNCs。制作皮瓣模型術(shù)后7 d，皮瓣上出現(xiàn)了明顯的成活和壞死分界（圖2A）。1×106細(xì)胞治療組的平均皮瓣存活率是（64.0±6.1）%，5×106細(xì)胞治療組的平均皮瓣存活率是（70.8±5.3）%，均顯著高于PBS對(duì)照組的存活率（54.3±2.5）%，P＜0.05；細(xì)胞治療組間沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖2B）。由此確定每只大鼠注射5×106，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)移植劑量。

圖2 確定細(xì)胞移植的有效劑量Fig.2 The identification of optim al cell dose for therapy

2.3 移植BM-MNCs和BMSCs促進(jìn)皮瓣成活

BM-MNCs治療組和BMSCs治療組的皮瓣成活率分別為（71.6±8.4）%和（66.2±3.1）%，都顯著高于PBS對(duì)照組的皮瓣成活率（55.9±3.4）%，P＜0.05；骨髓單個(gè)核細(xì)胞治療組和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組之間沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖3）。

圖3 BM-MNCs和BM SCs治療效果的比較Fig.3 The com parison of the theraputic effective of BM-MNCs and BMSCs

圖4 皮瓣微血管密度（*：P＜0.05；標(biāo)尺：100μm）Fig.4 Capillary density in skin flapsmeasured (*:P＜0.05;Scale bars:100μm)

2.4 隨意皮瓣的微血管密度

為計(jì)數(shù)細(xì)胞移植后皮瓣的微血管密度，對(duì)取下的標(biāo)本行CD31染色。結(jié)果顯示，BM-MNCs組和BMSCs組的微血管數(shù)量分別是（58.2±6.8）和（42.7±5.1），顯著高于PBS對(duì)照組（22.8±3.1），P＜0.05。另外，BMMNCs組也顯著高于BMSCs組（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

BM-MNCs和BMSCs的成血管潛能在前期的皮瓣模型和其他缺血性疾病中都有報(bào)道[6－7,10-14]。然而，哪一種細(xì)胞更適合臨床應(yīng)用還不明確。體外培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓細(xì)胞可以減少初始抽吸骨髓的量，但會(huì)隨著培養(yǎng)代次的增加喪失一些細(xì)胞的功能，并且長(zhǎng)期培養(yǎng)可能會(huì)帶來(lái)一些安全問(wèn)題。因此，有必要明確體外培養(yǎng)骨髓是否能夠給臨床治療帶來(lái)更多的好處。本研究發(fā)現(xiàn)，BM-MNCs和BMSCs都可以促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的成活率。更重要的是，注射了劑量相當(dāng)?shù)膩?lái)源于等質(zhì)等量骨髓的BM-MNCs和BMSCs，兩組皮瓣的成活率沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明目前的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)沒(méi)有給治療帶來(lái)幫助。

新生血管對(duì)于皮瓣缺血損傷后的存活具有重要作用。BMSCs已被用于治療許多缺血性疾病[15-18]，其機(jī)制主要是通過(guò)旁分泌一些生長(zhǎng)因子來(lái)保護(hù)存留的細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和血管的新生，并調(diào)控炎癥反應(yīng)[19-22]。研究表明，BMSCs有可能直接參與新血管的形成[23-24]。與BM-MNCs相比，BMSCs是相對(duì)純化的細(xì)胞，可能有益于減少細(xì)胞相關(guān)的副作用。然而，其他的成血管成分（比如內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血細(xì)胞）[25]在培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)逐漸丟失（圖2）。這可能是純化后的BMSCs與BM-MNCs相比，不具有治療上的優(yōu)勢(shì)的原因。

干細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)挑戰(zhàn)就是在培養(yǎng)過(guò)程中維持其“干性”。目前標(biāo)準(zhǔn)的BMSCs的培養(yǎng)過(guò)程被廣泛應(yīng)用，但并不完美[25-26]。有報(bào)道認(rèn)為，細(xì)胞在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中丟失了其多向分化潛能[25]。在本研究中，培養(yǎng)到第4代的BMSCs仍然具有多向分化潛能。與其他類似的研究相比，本研究采用的細(xì)胞注射劑量高于其他研究[7，27-30]，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSCs組并不優(yōu)于BM-MNCs組。

綜上所述，我們認(rèn)為，BM-MNCs和BMSCs都可以促進(jìn)大鼠隨意皮瓣的成活率。但是，相比之下，BM-MNCs具為方便、快捷，效果更優(yōu)，更符合臨床應(yīng)用的要求。或許，隨著B(niǎo)MSCs培養(yǎng)體系的進(jìn)一步優(yōu)化，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs能更好地維持其“干性”，能在今后的應(yīng)用中獲得優(yōu)勢(shì)地位，從而取代BM-MNCs。

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Com parison between Bone M arrow-derived Mononuclear Cells and M esenchymal Stem Cells in Promoting Survival Rates of Random-pattern Skin Flap in Rats

XU Peng,TANG Zhengya,LU Yang,ZHOU Guangdong,LIU Wei,CAO Yilin,ZHANGWenjie.Departmentof Plastic and Reconstructive Surgery,ShanghaiNinth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering CenterofChina,Shanghai200241,China.Correspondingauthor:ZHANGWenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

Objective To compare the non-cultured bone marrow mononuclear cells(BM-MNCs)and cultured bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in the promotion of random-pattern skin flap survival of rats.M ethods BMMNCs and BMSCs derived from two identical rat bonemarrow aspirateswere injected in a random-pattern skin flap model of rat(n=6).The survival areawas determined by its appearance,color and texture.Capillary density of flapswasmeasured by histology.Results The flap survival rates were(71.6±8.4)%in the BM-MNC-treated group and(66.2±3.1)%in the BMSC-treated group,both ofwhich were significantly higher than the control group(55.9±3.4)%.However,no significant difference was observed between the cell transplanted groups.According to vessel density assay,capillary density in the BM-MNC-treated group(58.2±6.8)was higher than in the BMSC-treated group(42.7±5.1),both ofwhich were significantly higher than the control group(22.8±3.1).Conclusion Pre-culture of BMSCs does not bring therapeutic benefits.

Random-pattern skin flap;Cell therapy;Bonemarrow mononuclear cells; Bonemarrow mesenchymal stem cells

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）02－0090－05

2015年2月3日；

2015年3月1日）

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”項(xiàng)目）（2011CB964704）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81271714，31170944）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；200241上海市組織工程國(guó)家工程中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。