王 巖，馮萬宇，劉 宇，李 丹，王 爽，史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

保護(hù)劑在益生菌保藏過程中的應(yīng)用

王 巖，馮萬宇，劉 宇，李 丹，王 爽，史同瑞

（黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006）

保護(hù)劑是影響益生菌活力最重要的外部因素，具有無免疫原性、無毒副作用、易溶解，能充分保持生物活性等特點(diǎn)，在益生菌保藏過程中可充分發(fā)揮其良好的保護(hù)效果。文章簡(jiǎn)單地介紹了保護(hù)劑的基本概念、分類情況，重點(diǎn)闡述了保護(hù)劑的作用機(jī)理和在益生菌保藏過程中的應(yīng)用情況，并對(duì)保護(hù)劑的應(yīng)用前景進(jìn)行了分析和展望。

保護(hù)劑；益生菌；保藏；冷凍；干燥

益生菌是定植于人與動(dòng)物體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效，從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。由于其較難長期保存，益生菌的保藏成了熱門研究課題。

益生菌的保藏過程是一個(gè)多步驟過程，例如冷凍干燥會(huì)產(chǎn)生低溫、凍結(jié)和脫水等多種效應(yīng)；即使成功完成冷凍干燥過程后，在長期保藏過程中也很難保證凍干制品活性組分的穩(wěn)定性。為了防止益生菌在冷凍干燥和貯藏過程中活性組分的變性，研究者們研究和探索了大量有效的保護(hù)添加劑。當(dāng)益生菌添加保護(hù)劑時(shí)，可以有效改變冷凍干燥時(shí)菌體細(xì)胞所處的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥對(duì)菌體細(xì)胞的損害，使益生菌保持原有的理化特性和生物活性，因此保護(hù)劑有效利用已成為提高菌種存活率的關(guān)鍵技術(shù)［1］。不同的保護(hù)劑各有優(yōu)缺點(diǎn)，單一保護(hù)劑不能滿足菌體抵抗外界惡劣環(huán)境的條件，而復(fù)配保護(hù)劑中各保護(hù)劑在冷凍干燥中則均發(fā)揮著各自的作用，同時(shí)相互間又具有協(xié)同作用［2］，因而將各保護(hù)劑調(diào)整合適的比例及濃度進(jìn)行復(fù)配，以達(dá)到對(duì)益生菌的最佳保護(hù)作用，才是研究者們今后研究和探索的方向。

1　保護(hù)劑概述及分類

保護(hù)劑也稱穩(wěn)定劑（stabilizer），是指一類能防止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時(shí)受到破壞的物質(zhì)。按分子量大小分為低分子化合物（lowmolecular compound）與高分子化合物（high molecular compound）；按其功能和性質(zhì)可分為凍干保護(hù)劑（lyoprotectant）、抗氧化劑（antioxidant）、填充劑（lyoprotectant）、酸堿調(diào)整劑（pH modifier）（表1）；按物質(zhì)的種類分類，可分糖/多元醇類（sugars/polyols）、聚合物類（polymers）、表面活性劑類（surfactants）、氨基酸類（aminoacids）、鹽類（salts）（表2）。

表1　保護(hù)劑的分類（一）

表2　保護(hù)劑的分類（二）

2　保護(hù)劑的作用機(jī)理

保護(hù)劑對(duì)益生菌的保護(hù)作用與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，目前普遍接受的機(jī)理主要是優(yōu)先化理論、水替代假說與玻璃化假說。前者主要用于闡釋在冷凍過程中保護(hù)劑的作用原理，后兩者用于解釋益生菌干燥過程中保護(hù)劑的作用機(jī)理。

優(yōu)先化理論涉及兩方面內(nèi)容：一是優(yōu)先水化，即蛋白質(zhì)優(yōu)先和水發(fā)生作用；二是優(yōu)先排斥，保護(hù)劑優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面進(jìn)入溶液中，使其能在冷凍的過程中發(fā)揮保護(hù)蛋白質(zhì)的作用［2］。此機(jī)理發(fā)揮保護(hù)作用的本質(zhì)是提高蛋白質(zhì)變性自由能，使蛋白質(zhì)變性過程條件更加苛刻以阻止蛋白質(zhì)變性［4］。由于在干燥過程中，蛋白質(zhì)參與水合作用的單層外殼已經(jīng)消失，故優(yōu)先交互作用機(jī)制不復(fù)存在，因此許多在溶液中能穩(wěn)定蛋白質(zhì)的輔料在干燥過程中不再具有保護(hù)作用［5］。

玻璃態(tài)假說認(rèn)為在凍干過程中，有些保護(hù)劑體系會(huì)隨溫度降低而使電解質(zhì)形成一種粘度極大的非晶體的玻璃態(tài)，保護(hù)劑體系發(fā)生玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化的溫度稱為玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度［4］。研究表明，單糖、雙糖、多羥基化合物以及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶等均能形成玻璃態(tài)，只是玻璃化轉(zhuǎn)變溫度不同。在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為，當(dāng)干燥蛋白質(zhì)藥物時(shí)，保護(hù)劑可緊密地包裹相鄰近的蛋白質(zhì)分子，形成一種在結(jié)構(gòu)上與冰相似的碳水化合物玻璃體，由于粘度高擴(kuò)散系數(shù)低，蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)能力減弱，其亞穩(wěn)態(tài)的構(gòu)象互變及構(gòu)象松弛減慢，大分子物質(zhì)的鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，使其伸展和聚集受到抑制，分子空間結(jié)構(gòu)得到維持，從而起到保護(hù)作用。

水替代假說認(rèn)為，在凍干過程中，由于糖類形成氫鍵能力較強(qiáng)，在氫鍵形成中既可作為孤對(duì)電子的受體，又可作為供體。因此，在凍干過程中，糖的羥基與蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)形成氫鍵而代替蛋白質(zhì)極性基團(tuán)周圍的水分子，使蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)可防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下仍保持其結(jié)構(gòu)與功能的完整性。DePaz等［6］研究顯示，雙糖能通過形成氫鍵與枯草桿菌蛋白酶結(jié)合取代水的位置，阻止干燥誘導(dǎo)的變性。Santivarangkna等［7］通過紅外光譜的方法發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑和蛋白質(zhì)在凍干過程中形成了氫鍵，由于不同的保護(hù)劑和不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差別都較大，所以它們之間形成氫鍵的能力也不相同。例如麥芽低聚糖的保護(hù)能力隨著二糖單位數(shù)量的增加而降低，這是由于蛋白質(zhì)相互作用的羥基數(shù)量減少造成的［8］。

3　保護(hù)劑在益生菌保藏過程中的應(yīng)用

在益生菌的保藏過程中，一種優(yōu)良的保護(hù)劑應(yīng)具備玻璃化溫度高、吸濕性能和結(jié)晶速率低及不具有還原性基團(tuán)等多種保護(hù)特性。單一保護(hù)劑的天然缺陷使其保護(hù)效果有限而致使其保護(hù)菌種不理想，研制復(fù)合型保護(hù)劑是當(dāng)今乃至今后一段時(shí)間內(nèi)益生菌保藏的重點(diǎn)方向和主要趨勢(shì)之一。但由于復(fù)合保護(hù)劑研究必然涉及復(fù)配的種類和用量的要求，而且同一配方的復(fù)合保護(hù)劑對(duì)于不同菌種保護(hù)效果也不完全相同，所以正確的試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)于益生菌復(fù)合保護(hù)劑的篩選就顯得非常重要了。

3.1保護(hù)劑在單一益生菌保藏過程中的應(yīng)用

在單一益生菌保藏過程中，可采用糖類、醇類、聚合物類、氨基酸類以及鹽類等物質(zhì)作保護(hù)劑。不同種類的保護(hù)劑也各有優(yōu)缺點(diǎn)，一些醇類雖對(duì)冷凍傷害有很好的預(yù)防作用，但由于吸濕性極強(qiáng)，一般不單獨(dú)用作凍干保護(hù)劑。大分子保護(hù)劑只能外部保護(hù)細(xì)胞表面免受損傷，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度升高，也不能減緩冰晶的生成從而減少凍干對(duì)細(xì)胞內(nèi)部的損傷，所以大分子保護(hù)劑單獨(dú)使用時(shí)，在保存期間對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果不明顯［9］，另外，不同保護(hù)劑對(duì)不同菌種的保護(hù)效果也不盡相同，這就需要通過反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)研究來確定效果最佳的復(fù)配保護(hù)劑。熊濤等［10］采用單因素和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)聯(lián)用的方法篩選和優(yōu)化植物乳桿菌NCU116真空冷凍干燥的保護(hù)劑配方的研究結(jié)果表明，海藻糖、D-山梨醇和脫脂奶粉3種保護(hù)劑效果好，能夠顯著提高菌種對(duì)冷凍干燥環(huán)境的耐受能力，以9.24%脫脂奶粉、4.47%海藻糖和13.42%D-山梨醇作為凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，細(xì)胞存活率可達(dá)（91.76±1.82）%，與理論預(yù)測(cè)值相符。Tadanori等［11］通過對(duì)海藻糖溶液中冰晶生長速率和形態(tài)學(xué)的研究表明，海藻糖溶液中冰晶生長速率要比純水中小得多，海藻糖抑制冰晶生長的能力是蔗糖的2倍。與蔗糖相比，它能顯著抑制冰晶生成的形態(tài)不穩(wěn)定性。他們認(rèn)為這是由于海藻糖能結(jié)合更多的水分所致。

胥振國等［12］對(duì)凍干高活力納豆芽胞桿菌菌粉保護(hù)劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化，結(jié)果表明，納豆芽胞桿菌的最佳冷凍干燥保護(hù)劑配方是脫脂乳粉10%、甘露醇4%、L-抗壞血酸鈉1%，其存活率達(dá)91.63%。菌粉在－20℃、4℃、25℃下保存12個(gè)月后，存活率分別為88.79%、70.16%和10.52%，說明菌粉在－20℃和4℃下保存穩(wěn)定性較好，25℃下保存穩(wěn)定性較差。劉松玲等［13］為提高長雙歧桿菌BBMN68的冷凍保藏效果，以冷凍存活率和菌株活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別評(píng)價(jià)了4個(gè)類型的18種冷凍保護(hù)劑。結(jié)果表明，脫脂乳、海藻糖、果糖、甘油、維生素C、L-Glu能對(duì)BBMN68有效保護(hù)。采用二次回歸正交設(shè)計(jì)對(duì)篩選的6種保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配，得到復(fù)配保護(hù)劑的最優(yōu)配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)為甘油3%、海藻糖5%、果糖5%、脫脂乳8%、維生素C 0.05%、L-Glu 0.05%。在復(fù)配保護(hù)劑的作用下，－80℃保藏期間BBMN68菌數(shù)穩(wěn)定，活菌對(duì)數(shù)值始終保持在105cfu/mL。冷凍濃縮物作為直投發(fā)酵劑應(yīng)用于酸奶中，在21 d內(nèi)菌數(shù)變化不大，始終保持在107cfu/mL以上。

王世寬等［14］采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用的方法，篩選優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌真空冷凍干燥的保護(hù)劑配方。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫脂奶粉、麥芽糖和谷氨酸鈉3種保護(hù)劑效果較好，能夠顯著提高菌種對(duì)冷凍干燥環(huán)境的耐受能力。以細(xì)胞存活率為響應(yīng)值，混合保護(hù)劑的最佳配方為脫脂奶粉7.06%、麥芽糖6.46%、谷氨酸鈉6.70%，植物乳桿菌冷凍干燥存活率達(dá)92.95%，凝結(jié)芽孢桿菌的冷凍干燥存活率達(dá)94.1%。

3.2保護(hù)劑在混合益生菌保藏過程中的應(yīng)用

在混合益生菌保藏過程中，也可采用糖類、醇類、聚合物類、氨基酸類、鹽類等物質(zhì)作為保護(hù)劑。由于混合益生菌是由幾種菌組合而成，這就需要所篩選的復(fù)配保護(hù)劑組方必須同時(shí)滿足幾種益生菌的要求，才能達(dá)到最佳的保護(hù)效果。陳賀佳等［15］將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌按3:2:1比例制備乳酸菌凍干保護(hù)劑。通過正交試驗(yàn)確定混合乳酸菌最佳保護(hù)劑配方為甘氨酸1.0%、脫脂乳10.0%、海藻糖7.0%、山梨醇1.0%。研究結(jié)果表明，冷凍干燥法制備的復(fù)合凍干保護(hù)劑對(duì)菌種保護(hù)效果優(yōu)于單一保護(hù)劑。杜磊等［16］通過在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌懸液中添加不同的保護(hù)劑，并測(cè)定了冷凍前后乳酸菌菌數(shù)，篩選出適用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌的保護(hù)劑。最終確定的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌保護(hù)劑配方為10%蔗糖、10%脫脂乳、5%谷氨酸鈉。菌體經(jīng)冷凍處理后，冷凍存活率可達(dá)95.00%，比不添加保護(hù)劑的菌體存活率大大提高。

4　保護(hù)劑的應(yīng)用前景

益生菌在冷凍干燥過程中容易造成部分菌體細(xì)胞的損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化，因此，為了提高益生菌凍干后的存活率，凍干前必須加入保護(hù)介質(zhì)來減少它的凍干損傷和增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。但蛋白質(zhì)的穩(wěn)定機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，對(duì)蛋白質(zhì)凍干制品的研究仍有待進(jìn)一步深化。開發(fā)更優(yōu)越的凍干保護(hù)劑，提高蛋白質(zhì)藥物凍干制品的質(zhì)量仍是現(xiàn)今生物技術(shù)藥物研究的重點(diǎn)與方向。在選擇復(fù)配保護(hù)劑時(shí)，通常采用不同種類的保護(hù)劑才能獲得顯著的保護(hù)效果，而且選用盡可能少的輔料種類對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有著重要意義。復(fù)配保護(hù)劑在冷凍干燥過程中發(fā)揮著各自作用的同時(shí)又具有相互協(xié)同作用，保護(hù)劑的比例及濃度達(dá)到協(xié)調(diào)時(shí)將會(huì)加速干燥，且能在干燥和保存期間維持較高的益生菌存活率，從而達(dá)到最佳保護(hù)效果，因此在選擇保護(hù)劑時(shí)要綜合考慮多種因素，盡量節(jié)約成本和減少工作量。相信隨著研究的不斷深入，益生菌保護(hù)劑的研究將具有更加廣闊的應(yīng)用前景，勢(shì)必會(huì)對(duì)促進(jìn)微生態(tài)制劑的健康發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。

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Application of Protector in the Preservation of Probiotics

WangYan，F(xiàn)engWanyu，Liu Yu，et al
（HeilongjiangVeterinaryScience Institutes，Qiqihar 161006，China）

Protector was the capital outside factor which possessed specialty of an-immunogenicity，toxic and side-effect，easy deliquescence and kept thoroughly biological activity.It had satisfactory conservancy effectiveness in probiotic preservation.This text introduced the basic concept，systematic status and mechanism of action，utilization state of protecting agent.At the same time，the application perspective was analyzed and looked intothe future.

protector；probiotic；preserve；freezing；dessication

S816.7

A

2095-3887（2015）03-0052-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.03.017

2015-03-16

王巖（1976-），女，高級(jí)獸醫(yī)師，大學(xué)本科，主要從事動(dòng)物微生態(tài)制劑的研究工作。