馬玉杰，袁興中*，彭 馨，劉 歡，包 姍，吳秀蓮，曾光明（1.湖南大學環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室，湖南 長沙 410082）

復配逆膠束體系中漆酶催化性能研究

馬玉杰1，2，袁興中1，2*，彭 馨1，2，劉 歡1，2，包 姍1，2，吳秀蓮1，2，曾光明1，2（1.湖南大學環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學環(huán)境生物與控制教育部重點實驗室，湖南 長沙 410082）

在由鼠李糖脂和Tween-80構建而成的復配逆膠束媒介研究了漆酶的催化性能.采用紫外法考察了Tween-80摩爾含量、逆膠束含水量、水相酸堿度、水相鹽度以及助表面活性劑種類等反應條件對漆酶催化性能的影響.研究結果表明，反應的最佳條件:Tween-80的摩爾含量為30%，體系含水量為20，緩沖溶液pH為4.5，KCI濃度為70mmol/L，助表面活性劑正己醇.并且在最佳條件下，漆酶在復配逆膠束體系中的酶活比在單相鼠李糖脂逆膠束中高1.44倍，比在水溶液中高4.35倍，研究結果表明復配表面活性劑在構建膠束酶學上具有很大的潛力.

復配逆膠束；鼠李糖脂；Tween-80；漆酶；催化性能

同傳統(tǒng)化學表面活性劑相比，鼠李糖脂作為一種環(huán)境友好型的天然表面活性劑，產生于微生物動物或植物的代謝過程中，具有低毒性、可生物降解性、生態(tài)相容性以及一定的膠團催化能力等優(yōu)點［15-16］，其對于推進逆膠束酶體系的應用意義重大.陰離子表面活性劑——鼠李糖脂，與酶具有強烈的靜電和疏水作用，導致其在逆膠束中的活性和穩(wěn)定性降低［17-18］.為解決這一難題，通常是加入非離子表面活性劑，減弱逆膠束體系的靜電作用與疏水性，從而減弱酶與表面活性劑的相互作用［5，13］.非離子表面活性劑Tween-80具有低毒、易生物降解、與離子型表面活性劑具較好協同性等特點.然而，目前向鼠李糖脂逆膠束體系中加入非離子表面活性劑Twenn-80以形成復配逆膠束體系來提高酶的催化性能的研究至今仍未見報道.

本文選擇鼠李糖脂和Tween-80進行復配，以異辛烷為連續(xù)相，短鏈醇為助表面活性劑，與水構成復配逆膠束體系.本實驗采用單因素法分別考察了非離子表面活性劑的摩爾含量、pH值、W0、離子濃度、助表面活性劑種類等重要因素對漆酶催化活性的影響，以確定鼠李糖脂/ Tween-80復配逆膠束體系的最佳狀態(tài)為其推廣到工業(yè)應用奠定實驗基礎.此研究拓展了酶反應的媒介，這對于構建適合于膠束酶學研究的逆膠束體系言有突出的實際意義.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABTS（Sigam公司）；鼠李糖脂（湖州紫金生物科技有限公司）；Tween-80（天津市化學試劑三廠）；漆酶（Sigam公司）；異辛烷、正己醇、正丁醇、正戊醇、正辛醇、正庚醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水乙醇和KCl等試劑均為市售分析純.超純水本實驗室自制.

紫外分光光度計（Shimadzu UV-2552， Japan）；超聲波清洗儀；pH計（PHS-2F，上海雷磁儀器廠）；磁力攪拌器.

1.2 實驗方法

1.2.1 復配逆膠束體系的制備 有機溶劑能夠影響到逆膠束水核中酶的活性和穩(wěn)定性，有研究證明相對于己烷和辛烷等有機溶劑，異辛烷對逆膠束中酶的性質影響最小，酶在異辛烷體系中的活性最高［19］.以鼠李糖脂和Tween-80為表面活性劑，異辛烷為油相，短鏈醇為助表面活性劑，100mmol/L的一定pH值和KCI濃度的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液作為水相，配制復配逆膠束.逆膠束的含水量以W0（無量綱，其大小等于水的摩爾數與總表面活性劑摩爾數之比）來表示.

1.2.2 漆酶酶活測定 取10μL 0.5mg/mlABTS加入不同參數的逆膠束溶液中，用分光光度計（Shimadzu UV-2550，Japan）測420nm處吸光度的變化，繪制酶活隨非離子表面活性劑的摩爾分數、W0、pH值、離子強度以及助表面活性劑的種類變化的圖形.每個實驗3個平行，取平均值，實驗溫度（29±1）℃.定義1個酶活力單位（U）為1umol的ABTS每min被轉化所需的酶量.

無錫禪意小鎮(zhèn)·拈花灣位于無錫馬山太湖國際旅游度假島，距離無錫市區(qū)三十余公里。拈花灣面湖依山，風景秀美，其命名源于佛教中“拈花微笑”的典故。作為靈山集團重點打造的五期工程，小鎮(zhèn)投資將近50億元，規(guī)劃建筑面積達到約35萬平方米。拈花灣通過對禪文化的創(chuàng)造性運用，打造成為“具有東方文化內涵的心靈度假目的地”。自2015年11月14日開園以來，已吸引了眾多的游客前來感受禪意生活。根據統(tǒng)計，2017年拈花灣的客流量為174.1萬人次。

1.2.3 相對酶活計算 以緩沖溶液中漆酶活性為對照，對照組的酶活設為100%.相對酶活=（不同參數組的酶活性/對照組酶活性）X100%.

2 結果與討論

2.1 Tween-80對漆酶活性的影響

研究表明，在逆膠束體系中加入適量的非離子表面活性劑有利于提高酶的催化活性［14，20-21］.非離子表面活性劑的加入增大了界面膜面積，降低了界面電荷密度和界面膜的剛性，促進底物與酶的活性位點接觸，從而提高酶的催化性能［14］.保持表面活性劑總濃度為0.05mol/L，考察Tween-80的摩爾分數［x（Tween-80）］對酶活性的影響，如圖1所示.

從圖1可以看出，酶活性隨x（Tween-80）的增大，先增大后減小.在x（Tween-80）為0%時，體系為單相鼠李糖脂逆膠束系統(tǒng)，漆酶的最大酶活為1.69U；在x（Tween-80）＞0%時，體系為復配逆膠束系統(tǒng)，漆酶的最大活性為4.13U，后者比前者高出1.44倍.在x（Tween-80）為30%時，活性達到最大，相對酶活為5.35，酶活性比在水溶液中提高了4.35倍.這一方面是由于Tween-80吸附在膠束界面上，減小了界面上的電荷密度及逆膠束的疏水性，減弱了酶分子與鼠李糖脂分子極性頭的靜電作用以及酶分子與逆膠束之間的疏水作用對酶活性產生的不利影響；另一方面Tween-80分子中的聚氧乙烯鏈可以與酶分子以氫鍵相結合［13］，從而減弱酶分子與鼠李糖脂分子的相互作用.因此，在一定范圍內隨著x（Tween-80）的增加，逆膠束的表面電荷的逐漸降低有利于酶的吸附，從而有利于底物與酶結合，所以酶活逐漸增大.然而Tween-80具有乳化作用，用量過大時會出現乳化現象，使逆膠束的結構發(fā)生變化，酶在逆膠束中的溶解能力降低，酶活性也隨之降低.選用x（Tween-80）=30%進行后續(xù)實驗.

圖1 Tween-80的摩爾分數對復配逆膠束體系中漆酶催化性能的影響Fig.1 Effect of x（Tween-80） on activity of laccase in the mixed reversed micelles system

2.2 W0對漆酶活性的影響

W0是影響逆膠束中酶活性的一個重要參數，其大小決定了逆膠束中心水核（表面活性劑分子疏水的非極性尾部指向有機溶劑，親水的極性頭部聚集形成的納米級中心水核［22］）尺寸的大小，從而影響酶的催化活力.研究表明，酶的催化反應是在環(huán)繞著酶分子表面的水層內進行的，只有與酶蛋白緊密結合的一層水分子對酶的催化活力才是重要的［23］.在W0為10～30范圍內研究了其對酶活性的影響，其結果如圖2所示.

研究結果表明，當W0較小時（＜15），逆膠束中心水核尺寸較小，酶分子的構象受到逆膠束微粒的限制，結構運動的自由度相對較小，酶的構象變化受到限制，使酶不易轉化為催化構象，酶的活力較低［24］.同時在W0較小的情況下，酶分子不能完全溶于逆膠束中心水核中，過多的酶分子暴露于有機溶液中，會降低酶的活性和穩(wěn)定性.當 15≤W0≤20時，酶的活性隨W0的增加變化較緩慢并且保持良好催化性能.這是由于隨著W0的增加，逆膠束中心水核尺寸增大，不僅有利于酶的催化構象的轉變，而且有利于酶分子被水和表面活性劑分子包裹，避免直接暴露于有機溶劑而失活酶［5］.當W0大于20時，隨著W0的增大酶的活性逐漸減小，這一方面是由于膠束內部水含量增加，會引起酶流動性的增大，從而導致酶催化構象的破壞，另一方面是由于當W0繼續(xù)增大時，逆膠束中心水核中水的活增大，將影響酶的活性［13］.與酶活相比，相對酶活的變化趨勢比較明顯，在W0=20時，相對酶活達到最大.綜合考慮酶活和相對酶活，在后續(xù)實驗中均采用W0=20.

圖2 含水量W0對復配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.2 Effect of W0 on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

2.3 pH值對漆酶活性的影響

在逆膠束體系中酶分子所處微環(huán)境的pH值決定了其所帶電荷的種類.因此，pH值不僅影響酶分子在逆膠束體系中的溶解度和催化構象，而且也有可能改變酶分子與逆膠束表面活性劑層之間的相互作用［25］.逆膠束微水相過高或過低的pH值條件都會引起酶活性的喪失，酶分子活性中心周圍的離子基團只有在特定的酸堿度下才具有酶催化反應的最佳離子態(tài).考察逆膠束水相pH值的改變對漆酶催化性能的影響，其結果如圖3所示.

當pH＜4.5時，隨著pH值的增加，表面活性劑與酶分子之間的靜電作用逐漸減小，酶的溶解度以及活性逐漸增強；當逆膠束內表面電荷即表面活性劑極性基團所帶的電荷與酶分子的等電點最接近時，二者產生靜電引力最小，酶的活性最大，此時pH=4.5；當pH值繼續(xù)增加時，表面活性劑與酶分子之間的靜電作用又有所增加，酶活性隨之降低.這與文獻［26］報道相一致漆酶在逆膠束中的最佳pH值在4.2～4.5，非離子型表面活性劑對最佳pH值影響不大，而主要取決于酶本身的性質.

圖3 pH值對復配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.3 Effect of pH on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

2.4 KCl對漆酶活性的影響

反應體系中緩沖液的離子強度影響酶的空間結構，從而影響其催化能力.逆膠束中心水核鹽濃度主要通過改變逆膠束結構和酶的空間結構兩種方式來影響逆膠束中酶的催化性能，水相中的鹽離子能影響表面活性劑分子極性頭部間的靜電作用，從而引起逆膠束聚集體大小和數目的改變［27］.研究鹽濃度對復配逆膠束中漆酶催化性能的作用，如圖4所示.從圖4可以看出，當鹽濃度較低時，酶活性開始隨離子強度增加而增加，最佳活性時離子強度為70mmol/L.適當增加鹽濃度能縮小逆膠束中心水核的體積，增加逆膠束結構的剛性，有利于溶解在其中的酶保持其催化活性［27］.隨后酶的活性下降，在高離子強度下，蛋白質由于變性而使酶活性大為降低，所以活性降低.彭子原等［28］的研究結果，KCl為10mmol/L時，漆酶在鼠李糖脂逆膠束體系中的活性達到最大，與本實驗相比，非離子表面活性劑的加入明顯提高了酶在逆膠束體系的耐鹽度.

圖4 KCI濃度對復配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.4 Effect of KCl concentration on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

2.5 不同醇種類對酶活性的影響

中短碳鏈的醇作為助表面活性劑，與表面活性劑分子共同組成界面層，使界面層上表面活性劑的數目減少，能調節(jié)表面活性劑的HLB值，增強體系的增溶能力，進而改變酶在逆膠束體系中的催化性能［26］.除此之外，還可以改變表面活性劑的親水基之間的作用，松散表面活性劑分子的排列［29］，使酶分子更容易進入逆膠束水核.采用正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇及正戊醇等5種正構醇作為助表面活性劑，分別加入有機相異辛烷中，探究助表面活性劑種類對漆酶催化性能的影響，其結果如圖5所示.

助表面活性劑能夠增加表面活性劑的溶解性，同時能夠促進表面活性劑極性端的結合，形成逆膠束［30］.Jolivalt等［29］研究表明，增加助表面活性劑的碳鏈長度會導致表面活性劑分子頭部集團之間的屏蔽作用降低，使得逆膠束體積變大，為酶催化反應提高足夠的空間，提高酶的活性.正如本實驗中正丁醇、正戊醇、正己醇作助表面活性劑時，醇的碳鏈增長，酶的活性依次增強.張文娟等［31］認為由于表面活性劑電荷性質、頭基大小及醇在聚集體結構中的定位等原因，醇對酶有激活作用，并且這種激活作用隨碳鏈長度的增加逐漸減小.由此，正庚醇和正辛醇對酶的激活作用弱于正己醇、正戊醇和正丁醇.上述原因的共同作用，從圖5看出，正己醇最適合作助表面活性劑.

圖5 助表面活性劑種類對復配逆膠束中漆酶催化性能的影響Fig.5 Effect of cosurfactant types on the catalytic performance of laccase in mixed reversed micelles system

3 結論

3.1 在最佳條件下鼠李糖脂/Tween-80復配逆膠束體系中漆酶的活性比在單相鼠李糖脂逆膠束中高出1.44倍，比在水溶液中高出4.35倍，漆酶在復配逆膠束體系中表現出了超活性，表面活性劑復配在膠束酶學中有巨大的潛力.

3.2 漆酶在復配逆膠束體系中表現出優(yōu)良的催化性能，其活性受到非離子表面活性劑的摩爾含量、含水量W0、水相酸堿度、水相鹽濃度、助表面活性劑等條件的影響.當總體表面活性劑濃度為0.05mol/L，反應的最佳條件:x（Tween-80）= 30%，含水量W0=20，水相pH值4.5，水相KCl濃度70mmol/L，助表面活性劑正己醇.

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Catalytic performance of laccase in mixed reversed micelle system.

MA Yu-jie1，2， YUAN Xing-zhong1，2*， PENG Xin1，2，LIU Huan1，2， BAO Shan1，2， WU Xiu-lian1，2， ZENG Guang-ming1，2（1.College of Environmental Science and Engineering，Hunan University， Changsha 410082， China；2.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control， Ministry of Education， Hunan University， Changsha 410082， China）. China Environmental Science， 2015，35（4）：1129～1134

A mixed reversed micelle system had been developed to investigate the catalytic performance of laccase. The anionic biosurfactant Rhamnolipid and nonionic surfactant Tween-80 were used to construct the mixed reversed micelle system， while the isooctane and short-chain alcohols （1:1， V/V） were used as oil phase and cosurfactant， respectively. UV spectrum was analysed to find out how the molar fraction Tween-80， water content， pH， ionic strength and cosurfactant stype affected enzyme activity of laccase in the mixed reversed micelle system. And it has been found that while the molar fraction Tween-80 was 30%， water content was 20， pH was 4.5， the concentration of KCl was 70mmol/L， cosurfactant stype was n-hexanol， the optimal condition of mixed reversed micelle system could be reached. In optimum catalytic conditions， the catalytic activity was higher 1.44 times in the mixed reversed micelle than that in the single Rhamnolipid reversed micelle system， and higher 4.35 times than that in water. The research indicated mixed reversed micelle has huge potential in micellar enzymology.

mixed reversed micelle system；Rhamnolipid；Tween-80；laccase；catalytic performance

X703.5

A

1000-6923（2015）04-1129-06

馬玉杰（1984-），女，河南周口人，湖南大學環(huán)境科學與工程學院碩士研究生，研究方向為廢物資源化.

2014-07-18

國家自然科學基金資助項目（50978087）

* 責任作者， 教授， yxz@hnu.edu.cn