劉文碩 南飛飛 賈思思 李素彩 張明智 張蕾

·臨床研究與應(yīng)用·

結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤檢測EB病毒與療效關(guān)系的研究*

劉文碩 南飛飛 賈思思 李素彩 張明智 張蕾

目的：探討血漿中EB病毒陽性在評價結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤近期療效和遠期療效中的臨床意義。方法：收集2011年1月至2014年4月鄭州大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理及免疫組化確診為結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤的患者109例，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測其血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)，比較EBV陰性和EBV陽性患者對治療療效與預(yù)后的差異。結(jié)果：109例結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者，53例陽性患者中有34例（64.2%）為晚期（Ⅲ～Ⅳ期），56例陰性患者中22例（39.3%）為晚期（Ⅲ～Ⅳ期），EBV陽性組中伴有B癥狀33例（62.3%），陰性組患者21例（37.5%），EBV陰性患者與EBV陽性患者在分期及B癥狀方面均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。34例（60.7%）EBV陰性結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者達到客觀緩解率，顯著高于EBV陽性患者的客觀緩解率（22例，41.5%）（P＜0.05）。EBV陰性組與EBV陽性組相比，其2年無進展生存期更高（P＜0.05）。結(jié)論：檢測結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者血漿中EB病毒對評價其近期療效及2年無進展生存期具有重要的臨床意義。

結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤 qRT-PCR方法 EB病毒 無進展生存期

結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤，鼻型（extranodal NK/ T-cell lymphoma，nasaltype）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）的一種少見類型，約占非霍奇金淋巴瘤的2%～10%。其發(fā)病具有地域性，多見于亞洲和南美，中國、韓國、日本、墨西哥、秘魯?shù)葒野l(fā)病率高，約占總發(fā)病例數(shù)的70%，而北美、歐洲發(fā)病率低，約占總發(fā)病數(shù)的21%［1-3］。多數(shù)患者原發(fā)于鼻腔和咽喉部以上部位，少數(shù)病例原發(fā)于鼻外，如皮膚、胃腸道、肺等，無明顯鼻腔受累［4-5］。其病理表現(xiàn)獨特，具有以血管為中心的多形性淋巴細胞浸潤、瘤細胞浸潤破壞血管繼而引起壞死等特點［6］，多數(shù)病例與EB病毒感染有關(guān)［7-9］。近來國內(nèi)外部分

研究表明，結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)病與EBV-DNA拷貝數(shù)相關(guān)［10-11］，但有關(guān)EBV-DNA拷貝數(shù)與結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤療效及預(yù)后的相關(guān)研究甚少，且病例數(shù)較少。本研究通過檢測結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)，探討不同EBV-DNA拷貝數(shù)對評價其療效及預(yù)后的臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料收集2011年1月至2014年4月鄭州大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者109例。其中男性68例，女性41例，中位年齡為40歲，Ann Arbor分期早期（Ⅰ+Ⅱ）53例，晚期（Ⅲ+Ⅳ）56例，β2微球蛋白正常者72例，升高者37例，乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）正常者84例，升高者25例，無B癥狀者（發(fā)熱、體重減輕、盜汗）55例，有B癥狀者（發(fā)熱、體重減輕、盜汗）54例。1.1.2試劑與儀器EB病毒核酸擴增（PCT）熒光定量檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司；酶標儀（Thermo公司，Multiskon，Mk3），核酸提取儀（羅氏MagNA Pure LC 2.0），PCR儀（ABI Prism 7500）。

1.2方法

1.2.1檢測方法抽取結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者外周血2 mL于EDTA抗凝管中，3 500 r/min離心5 min，分離其上層血漿，提取50 μL血漿與50 μL DNA提取液（試劑盒內(nèi)提供）混勻，浸入100℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心分離上清液，取2 μL上清液與樣本行PCR檢測，操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.2EBV-DNA拷貝數(shù)分析根據(jù)血漿EBV-DNA拷貝數(shù)將其分為EBV陰性組（EBV-DNA＜5×102copies/mL）和EBV陽性組（EBV-DNA≥5×102copies/mL）（5×102～8.67×107copies/mL），EBV中位拷貝數(shù)為2.32×104copies/mL。

1.2.3觀察指標及療效評價結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者每化療2個周期復(fù)查EBV拷貝數(shù)、LDH、β2微球蛋白及影像學檢查進行療效評價。根據(jù)2007年WHO惡性淋巴瘤療效評價的修訂標準，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、病情穩(wěn)定（stable disease，SD）、疾病進展（progressive disease，PD）。以CR+PR計算客觀緩解率（objective response rate，ORR），以CR+PR+SD計算疾病控制率（disease control rate，DCR），并觀察兩組的2年無進展生存期（progression-free survival，PFS）情況。

1.3統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同EBV-DNA拷貝數(shù)組間客觀緩解率及疾病控制率的比較均采用χ2檢驗。EBV-DNA拷貝數(shù)與2年無進展生存期的關(guān)系采用Kaplan-Meier法和Breslow檢驗。

2 結(jié)果

2.1結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者EB病理感染率

109例結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者中，EBV陽性53例，陰性56例，EBV感染率為48.6%。

2.2結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者的臨床病例資料分析

109例結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者53例陽性患者中有34例（64.2%）為晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者，56例陰性患者中22例（39.3%）為晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009）；EBV陽性患者伴有B癥狀者33例（62.3%），明顯高于陰性組患者的21例（37.5%，P=0.01）。而EBV陽性組與EBV陰性組患者在年齡（P=0.185）、性別（P=0.98）、β2微球蛋白（P= 0.105）及LDH（P=0.08）方面均無顯著性差異（表1，P＞0.05）。

表1 結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者的臨床病理特征分析例Table 1Analysis of the clinical and pathological characteristics of patients with extranodal NK/T-cell lymphoma

2.3結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者EB病毒感染與近期療效關(guān)系

109例結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者中，EBV陰性組的客觀緩解率和疾病控制率分別為60.7%（34/56）和78.6%（44/56），EBV陽性組分別為41.5%（22/53）和62.3%（33/53），二者比較客觀緩解率有顯著性差異（P=0.045），而疾病控制率無顯著性差異（P=0.062，表2）。

表2 EB病毒與近期療效的關(guān)系n（%）Table 2Relationship between EB virus infection and short-time effects

2.4EB病毒陽性與結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者2年P(guān)FS關(guān)系

109例結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者能進入2年P(guān)FS評價的患者共59例，其中EBV陰性者36例，EBV陽性者23例，兩組病例均無失訪。EBV陰性患者2年P(guān)FS為38.9%，EBV陽性患者2年P(guān)FS為17.4%。EBV陰性組與EBV陽性組2年P(guān)FS分別為33.5個月和13.3個月，中位生存期分別為12.5個月和7.8個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01，圖1）

圖1 兩組患者2年無進展生存期比較Figure1Comparison of the 2-year PFS rates between the two groups of patients

3 討論

Epstein－Barr病毒（EBV）由Epstein和Barr于1964年在Burkitt淋巴瘤標本的體外傳代細胞中發(fā)現(xiàn)，是人皰疹病毒γ亞科嗜淋巴細胞病毒屬的DNA病毒，具有嗜淋巴細胞和上皮細胞的特性。在細胞外成熟的病毒顆粒為球形，直徑為150～180 nm，EBV病毒基因是線性雙鏈DNA，基因組長平均為172kb，EBV以潛伏感染最為常見，人群普遍易感，EBV可長期潛伏在被感染的B細胞內(nèi)，形成持續(xù)的潛伏感染，僅極少數(shù)可發(fā)展為EBV相關(guān)的上皮細胞惡性腫瘤和淋巴瘤［12-13］。本研究中EBV陽性率為48.6%，低于Kanavaros等［14］研究報道，可能與本研究中統(tǒng)計的病例包括鼻腔及鼻型結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者及地域差異有關(guān)。

結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤與EBV感染有密切關(guān)系，大多數(shù)患者表現(xiàn)為EBV陽性，且與種族和發(fā)病部位無關(guān)，提示EBV是致病因素或起到病原學的作用［15］。隨著分子生物學技術(shù)的進展及淋巴瘤發(fā)病機制及預(yù)后研究進展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EB病毒在結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，Au等［16］研究報道，通過qRT-PCR定量檢測患者血清中EBV-DNA［17］，DNA拷貝數(shù)高者臨床分期較拷貝數(shù)低者增高，預(yù)后差，提示EBV-DNA檢測可作為判斷NK/ T細胞淋巴瘤預(yù)后的重要指標。本研究中EBV陽性與EBV陰性組患者在Ann Arbor分期及B癥狀方面有統(tǒng)計學差異，EBV陽性患者可能更易表現(xiàn)出發(fā)熱、體重減輕、盜汗等癥狀，且EBV陽性的結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者分期可能較晚。我們將進一步研究，是否可以通過抑制EB病毒或通過降低EBV-DNA復(fù)制率來緩解患者發(fā)熱、盜汗等伴隨癥狀，及提高結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者的療效。

本研究比較了EBV陰性組及EBV陽性組間近期療效及2年無進展生存期，研究結(jié)果提示EBV-DNA陰性者較EBV-DNA陽性者客觀緩解率及2年無進展生存期均更佳，客觀緩解率分別為60.7%和41.5%，中位生存期分別為12.5個月和7.8個月，2年無疾病進展期分別為33.5個月和13.3個月。結(jié)果與劉陽等［17］報道相似。但EBV-DNA陰性組與EBV-DNA陽性組疾病客觀控制率間無明顯統(tǒng)計學差異，可能是由于本研究病例資料較少有關(guān)。

本研究提示檢測EB病毒對評價結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤近期療效及2年無進展生存期有一定臨床意義，有無EB病毒感染有望成為評價結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤近期療效的指標之一。動態(tài)監(jiān)測血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)對評價疾病近期療效有一定的意義。但因EB病毒可以存在于正常人血漿中，不能單純以EBV-DNA拷貝數(shù)作為評價疾病療效的指標，需結(jié)合影像學及骨髓穿刺等結(jié)果判斷。

本研究結(jié)果示，EB病毒在評價結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤疾病控制及療效中具有一定的臨床意義，但是否可以通過抗病毒或其他方法抑制血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)，以期提高結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤疾病有效率及無進展生存期，需要進行更深一步的研究。有關(guān)結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤治療過程中EBV-DNA拷貝數(shù)的動態(tài)變化與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，現(xiàn)尚無相關(guān)報道，需要更多的學者繼續(xù)研究。

因本研究時間較短，絕大多數(shù)患者處于疾病緩解狀態(tài)，故EB病毒陽性在評價結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤患者中位PFS和OS中的意義尚不能統(tǒng)計，將繼續(xù)觀察，并對相關(guān)資料做進一步的統(tǒng)計及研究。

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（2014-10-21收稿）

（2014-01-05修回）

（編輯：鄭莉）

Detecting EB virus to determine curative effect in extranodal natural killer/T-cell lymphoma

Wenshuo LIU,Feifei NAN,Sisi JIA,Sucai LI,Mingzhi ZHANG,Lei ZHANG

Lei ZHANG;E-mail:zl2909@163.com

Objective:To investigate the clinical significance of detecting Epstein Barr virus(EBV)infection in evaluating recent curative and long-term effects in patients with extranodal natural killer(NK)/T-cell lymphoma.Methods:The EBV-DNA copies in the plasma of 109 patients,who were pathologically and immunohistochemically diagnosed with extranodal natural killer/T-cell lymphoma in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University between January 2011 and April 2014,were monitored via quantitative real-time polymerase chain reaction.Subsequently,the difference in recent curative and long-term effects between EBV positive and EBV negative patients was compared.Results:Among the 109 patients with extranodal NK/T-cell lymphoma,34(64.2%)cases of EBV positive patients were at the advanced stage(Ⅲ～Ⅳstages),and 22(39.3%)cases of EBV negative patients were at the terminal stage (Ⅲ～Ⅳstages).EBV positive patients who accompanied by B symptoms were 33(62.3%),and there were 21(37.5%)cases with B symptoms in EBV negative patients,the differences between stages and B symptoms were statistically significant.The attained objective response rate of the EBV-DNA negative patients(34,60.7%)was significantly higher than that of the EBV-DNA positive patients (22,41.5%)(P<0.05).Similarly,the 2-year progression-free survival(PFS)rate of EBV negative patients was better than that of EBV positive patients(P<0.05).Conclusion:Detecting EBV in plasma has clinical significance in evaluating the recent curative effect and the 2-year PFS rate in patients diagnosed with extranodal NK/T-cell lymphoma.

extranodal natural killer/T-cell lymphoma,quantitative real-time polymerase chain reaction,Epstein Barr virus,progression-free survival

10.3969/j.issn.1000-8179.20141768

河南省鄭州市鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（鄭州市）

*本文課題受國家自然基金項目（編號：81172118）資助

張蕾zl2909@163.com

Department of Oncology,the FirstAffiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81172118)

劉文碩專業(yè)方向為惡性淋巴瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

E-mail：linwenshuo19910110@126.com